金水六君煎及其拆方含药血清对A549细胞中黏蛋白MUC5AC及水通道蛋白AQP5表达的影响

柏正平 刘雨 谭小宁 谭电波 邓秀娟 李仲普 刘俊 谭光波

〔摘要〕 目的 觀察金水六君煎及其拆方含药血清对肺腺癌细胞A549黏液高分泌模型黏蛋白5AC（MUC5AC）及水通道蛋白5（AQP5）表达的影响，探讨金水六君煎治疗气道黏液高分泌的作用机制。方法 将A549细胞分为空白组、模型组、金水六君煎组、养阴组、化痰组。采用人中性粒弹性蛋白酶（HNE）25 nmmol/L诱导A549细胞黏液高分泌，20%金水六君煎及其拆方含药血清干预24 h。RT-PCR、Western blot法检测细胞MUC5AC、AQP5基因与蛋白表达。ELISA法检测细胞上清液MUC5AC、AQP5蛋白表达。结果 与空白组比较，模型组细胞MUC5AC mRNA与蛋白表达明显增多（P<0.05），AQP5 mRNA与蛋白表达明显降低（P<0.05）。与模型组比较，金水六君煎组及养阴组细胞MUC5AC mRNA表达明显降低（P<0.05），AQP5 mRNA表达明显增多（P<0.05）;化痰组A549细胞MUC5AC蛋白表达显著降低（P<0.01），AQP5蛋白表达明显升高（P<0.05）。模型组细胞上清液MUC5AC、AQP5蛋白表达较空白组差异无统计学意义（P>0.05）。结论 金水六君煎可明显抑制A549细胞MUC5AC产生，促进AQP5表达，纠正黏蛋白/水盐比例失衡可能是其治疗气道黏液高分泌的可能机制。

〔关键词〕 金水六君煎;A549细胞;黏液高分泌;黏蛋白;水通道蛋白

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.03.008

Effects of Serum Containing Jinshui Liujun Decoction and Its Components on the Expression of Mucin MUC5AC and Aquaporin AQP5 in A549 Cell Mucus Hypersecretion Model

BAI Zhengping1， LIU Yu1， TAN Xiaoning2， TAN Dianbo2， DENG Xiujuan2， LI Zhongpu2， LIU Jun2， TAN Guangbo2*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China）

〔Abstract〕  Objective To investigate the effects of Jinshui Liujun Decoction and its components on the expression of mucin 5AC （MUC5AC） and aquaporin 5 （AQP5） in the mucus hypersecretion model of human lung adenocarcinoma A549 cells， and to explore the mechanism of action of Jinshui Liujun Decoction in the treatment of airway mucus hypersecretion. Methods A549 cells were divided into blank group， model group， Jinshui Liujun Decoction group， Yin-nourishing group， and phlegm-resolving group. Mucus hypersecretion in A549 cells was induced using human neutral elastase （HNE） at a concentration of 25 nmmol/L， followed by intervention with 20% serum containing Jinshui Liujun Decoction and its components for 24 h. RT-PCR and Western blot were used to determine the mRNA and protein expression levels of MUC5AC and AQP5. Meanwhile， enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure the expression of MUC5AC and AQP5 in cell supernatant. Results Compared with the blank group， the model group had significantly increased expression of MUC5AC mRNA and protein （P<0.05） and significantly reduced  expression of AQP5 mRNA and protein （P<0.05）. Compared with the model group， the Jinshui Liujun Decoction group and the Yin-nourishing group had significantly reduced expression of MUC5AC mRNA （P<0.05） and significantly increased expression of AQP5 mRNA （P<0.05）. The phlegm-revolving group showed a significant reduction in the expression of MUC5AC protein （P<0.01） and a significant increase in the expression of AQP5 protein （P<0.05）. There was no significant difference in the protein expression of MUC5AC and AQP5 in cell supernatant between the model group and the blank group （P>0.05）. Conclusion Jinshui Liujun Decoction can significantly inhibit the expression of MUC5AC and promote the expression of AQP5 in A549 cells. Its ability to correct the imbalance of mucin/water-salt ratio may be a possible mechanism for the treatment of airway mucus hypersecretion.

〔Keywords〕 Jinshui Liujun Decoction; A549 cell; mucus hypersecretion; mucin; aquaporin

慢性阻塞性肺病（chronic obstruetive pulmonary

diseases， COPD） 是呼吸系统的一种慢性疾病，气道黏液高分泌是其重要病理生理特征，黏液高分泌可导致气道阻塞、气流受限、通风灌注错配及气体交换减值与细菌定植，从而加速FEV1下降过程[1]。气道黏液高分泌除黏蛋白的绝对量增多外，还与黏蛋白/水盐比例失衡有关，其中黏蛋白5（MUC5AC）决定黏液的黏度，水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）调节肺泡内的水的转运和黏蛋白/水盐比例。COPD黏液高分泌机制中MUC5AC表达明显升高，AQP5表达显著降低[2]。金水六君煎出自《景岳全书》，临床主要应用于治疗阴虚痰饮证，临床研究能明显改善肺肾阴虚型慢性支气管炎及COPD患者咳喘痰多，药效学研究能明显增加气管液体分泌量，促进痰液排出[3-6]，但其治疗气道黏液高分泌机制研究未见报导。本文将金水六君煎拆方成养阴组分及化痰组分进行研究，采用人中性粒弹性蛋白酶诱导肺腺癌细胞A549建立气道黏液高分泌细胞模型，通过观察金水六君煎及其拆方对黏蛋白MUC5AC、水通道蛋白AQP5表达的影响，探讨金水六君煎治疗气道黏液高分泌的可能机制，为金水六君煎临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1  材料

1.1.1  实验动物  雄性SD大鼠40只，鼠龄10～12周，体质量（220±20）g，由湖南省斯莱克实验动物中心提供，许可证号[SYXK（湘）2016-0002]，合格证号：N0.43004700042712。饲养于温度22～26 ℃、相对湿度50%～70%环境，通风换气8～12次/h，自由摄食饮水。

1.1.2  细胞株  肺腺癌A549细胞系（A549），购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，批号：1606-1。

1.1.3  实验药物  金水六君煎方药组成根据《景岳全书》原方组成及剂量：熟地黄15 g，当归6 g，半夏6 g，陈皮4.5 g，茯苓6 g，炙甘草3 g。加入生姜10 g。养阴组：熟地黄15 g，当归6 g。化痰组：半夏6 g，陈皮4.5 g，茯苓6 g，炙甘草3 g。中药饮片购自湖南省中医药研究院附属医院。

1.1.4  主要试剂  人中性粒弹性蛋白酶（英国abcam公司，货号：ab91099）;DMEM（美国HyClone公司）;胎牛血清（美国Gibco公司）;0.25%胰酶消化液（美国Gibco公司）;1%青霉素和链霉素（上海慧颖生物技术有限公司）;MUC5AC、AQP5 ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，货号：Y15037320、Y10037321）;小鼠MUC5AC单克隆抗体（美国SantaCruz公司，货号：45M1）;AQP5兔多克隆抗体（英国abcam公司，货号：ab78486）;HRP goat anti-mouse/ Rabbit IgG（美国Proteintech公司），RIPA裂解液/蛋白酶抑制剂，SuperECL Plus 超敏发光液（美国Thermo公司）;5X蛋白上样缓冲液（上海碧云天生物技术有限公司）;β-actin、MUC5AC、AQP5引物（上海生工生物工程股份有限公司）;逆转录试剂盒、UltraSYBR Mixture（北京康为世纪生物技术有限公司）;SYBRGREEN I核酸染料（北京普博欣生物科技责任有限公司）。

1.1.5  主要仪器  细胞培养箱（美国Thermo公司，HERAcell 2401）;倒置显微镜（北京同舟同德仪器仪表有限公司，DSZ2000）; 全自动酶标仪（意大利Diasorin公司，MAX3000）;台式冷冻离心机（力新仪器上海有限公司，Neofuge23R）;电泳仪（美国Biorad，164-5050）;转膜仪（北京六一仪器厂，DYCZ-40A）;全自动凝胶成像分析系统（英国Syngene公司，GBOX-H12-E-M）;荧光PCR板（美国Thermo公司，SPL0960）;荧光定量RCP仪（美国Thermo公司，PIKO REAL96）。HERAcell2401

1.2  方法

1.2.1  含药血清制备  按照随即数字表法将40只雄性SD大鼠平均分为空白组、金水六君煎组、养阴组、化痰组，每组10只。大鼠给药剂量参考按中药血清药理学研究通法[7]（给药剂量=临床常用量×动物有效剂量系数×培养基内的稀释度）。参考人和动物体表面积折算的等效剂量比率表，大鼠的等效剂量相当于人的6.3倍，每只动物每千克体质量给药量按临床人（70 kg）的等效量，培养基内血清的稀释度为5倍。换算出生金水六君煎组、养阴组、化痰组生药含量分别为：22.72 g/kg、9.45 g/kg、8.77 g/kg。中药煎煮按生药量加入10倍水，煎煮1 h保存藥液，药渣再加入8倍量水，煎煮1 h，合并过滤去沉淀浓缩成所需浓度：2.27 g/mL、0.96 g/mL、0.88 g/mL。参考目前常用“通法”[8]，按照10 mg/kg灌胃量每天给药2次，连续3 d，空白对照组灌胃等体积生理盐水。末次给药1 h后无菌条件下腹主动脉采血，3 000 r/min离心5 min，取血清，同组血清相混合，置于56 ℃水浴灭活补体30 min，过滤器（0.22 μm孔径）过滤除菌，-20 ℃保存备用。

1.2.2  细胞培养  将A549细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/m青链霉素的DMEM培养液中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每2 d换液1次，按1∶3比例传代。

1.2.3  细胞分组及干预  取对数期细胞进行实验，分为正常对照组、模型组、金水六君煎组、养阴组和化痰组，每组设3个复孔。黏液高分泌细胞模型制备参考兰箭[9]人中性粒细胞弹性蛋白酶（human

neutrophi lelastase， HNE）诱导法。根据预实验结果采用终浓度为25 nmmol/L HNE，20%含药血清干预细胞。每孔以1×105/mL密度接种于6孔板，加入DMEM培养基+10%FBS，37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h至细胞贴壁。去原培养基，加入无血清DMEM培养基，37 ℃、5%CO2培养箱饥饿培养24 h。去培养基，以孔为单位，分为空白组（加入20%空白组大鼠血清）、模型组（加入20%空白组大鼠血清和终浓度为25 nmmol/L HNE）、金水六君煎组（加入20%金水六君煎含药血清和终浓度为25 nmmol/L HNE）、养阴组（加入20%养阴组含药血清和终浓度为25 nmmol/L HNE）、化痰组（加入20%化痰组含药血清和终浓度为25 nmmol/L HNE），37 ℃，5%CO2培养24 h后收集细胞及培养液上清进行检测。

1.2.4  RT-PCR法检测A549细胞MUC5AC、AQP5基因表达  吸掉各组A549细胞上层培养液，向A549细胞中加入1 mL Trizol室温裂解5 min后充分吹打，采用酚/氯仿萃取法提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计测定RNA浓度以及260、280 nm处吸光度值，计算其纯度。按HiFiScript cDNA Synthesis Kit说明书合成cDNA，然后以cDNA为模板按UltraSYBR Mixture合成试剂盒说明书进行扩增。反应体系：2×SYBGREEN PCR Master Mix 15 ？滋L，Primer F（10 ？滋mol/L）1 ？滋L，Primer R（10 ？滋mol/L）1 ？滋L，ddH2O 11 ？滋L，cDNA 2 ？滋L，总体积共30 ？滋L。扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火50 s，共40个循环。根据所得Ct值，以β-actin为内参、空白组样本为对照样品计算2-ΔΔCt，得到目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

1.2.5  Western blot法检测A549细胞MUC5AC、AQP5蛋白表达  用预冷PBS洗涤各组A549细胞，吸掉上清，加入160 ？滋L RIPA裂解液冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 r/min离心15min提取总蛋白。按照BCA蛋白定量试剂盒操作说明测定蛋白浓度。分别配制分离胶浓度为8%（分离MUC5AC）和10%（分离AQP5及β-actin）SDS-聚丙烯酞胺凝胶。在加样孔按顺序加入蛋白样本20 ？滋L及蛋白Marker 3 ？滋L，按浓缩胶恒压80 V，分离胶120 V进行电泳，待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。湿转法将蛋白质转移至PVDF膜，恒流300 mA MUC5AC约2 h，AQP5及β-actin约1 h。5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，加入1×TBST稀释的小鼠MUC5AC单克隆抗体（1∶200）、AQP5兔多克隆抗体（0.1 ug/mL）和β-actin（1∶5 000），4 ℃冰箱孵育过夜。孵育结束后1×TBST洗3次×10 min，加入辣根过氧化物酶标记鼠二抗和兔二抗（1∶5 000），室温下孵育1.5 h，1×TBST洗涤3次后置于ECL发光液中显影，暗室曝光冲印，采用BioRad成像系统分析电泳条带，QuantityOne图像分析软件计算基因与β-actin比值。

1.2.6  ELISA法检测A549细胞上清液MUC5AC、AQP5蛋白表达  吸取各组A549细胞培养液1 mL置于1.5 mL EP管，4 ℃、12 000 r/min离心5 min沉淀悬浮细胞，取上清液500 ？滋L进行实验。严格按照试剂盒说明书进行标准品、酶结合物、显色剂制备和样品稀释，在反应终止后10 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度（OD值），通过标准曲线计算各样品浓度。

1.3  统计学方法

采用SPSS 19.0软件对结果进行统计学分析，所有数据以“x±s”表示。资料符合正态性及方差齐性时，组间比较采用单因素方差分析（analysis of variance， ANOVA）;不满足正态性或方差齐性时，采用非参数检验秩和检验。结果以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1  各组A549细胞MUC5AC mRNA、AQP5 mRNA表达

与空白组比较，模型组A549细胞MUC5AC mRNA表达明显升高（P<0.05），AQP5 mRNA表达明显减少（P<0.05）。与模型组比较，金水六君煎组及养阴组MUC5AC mRNA表达明显降低（P<0.05），AQP5 mRNA表达明显增加（P<0.05），化痰组MUC5AC mRNA、AQP5 mRNA表達较模型组无明显差异（P>0.05），结果见表2。MUC5AC与AQP5扩增曲线和溶解曲线如图1。

2.2  各组A549细胞MUC5AC、AQP5蛋白表达

与空白组比较，模型组A549细胞MUC5AC蛋白表达显著升高（P<0.01），AQP5蛋白表达明显减少（P<0.05）。与模型组比较，金水六君煎组及化痰组MUC5AC蛋白表达明显降低（P<0.05，P<0.01），化痰组AQP5蛋白表达明显增加（P<0.05），金水六君煎组及养阴组AQP5蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表3，图2。

2.3  各组A549细胞培养液MUC5AC、AQP5蛋白表达

与空白组比较，各组培养液中MUC5AC、AQP5蛋白表达无明显差异（P>0.05）。与模型组比较，金水六君煎组及养阴组培养液AQP5蛋白表达增加（P<0.05）。见表4。

3 讨论

气道黏液高分泌是COPD重要的病理特征，与COPD患者的肺功能加速下降、急性加重及高住院治疗率密切相关，祛痰治疗应面向所有的COPD患者[10]。MUC5AC是成人呼吸道最主要的黏蛋白，气道黏液高分泌过程MUC5AC表达明显升高。AQP5主要表达于肺内且对肺泡内的水的转运和黏膜下腺泡的黏液分泌起着重要的作用。COPD气道黏液高分泌中黏蛋白MUC5AC表达明显增高，AQP5表达降低。体内及体外实验研究证实抑制AQP5表达，可导致MUC5AC表达明显增多[11-12]。

金水六君煎出自《景岳全书》，其主治肺肾虚寒，水泛为痰，或年迈阴虚、气血不足外受风寒，咳嗽呕恶多痰，喘急等证。其组方由二陈汤（半夏，陈皮，茯苓，甘草）及贞元饮（熟地黄，当归，炙甘草）组合而成，方中当归、熟地黄滋肺肾阴血以治本，二陈汤燥湿化痰以治标，全方标本兼治[13]。

目前用于黏液高分泌的细胞模型主要有人黏液上皮细胞癌细胞株NCI-H292、人肺腺癌细胞株A549、人原代支气管上皮细胞NHBE。A549因具有黏液合成分泌的特性、稳定性高、易于培养和传代等优点，已广泛用于气道黏液高分泌体外研究[14-15]。人中性粒弹性蛋白酶（HNE）主要由中性粒细胞释放，是一种高效的黏液促分泌剂，能更好模拟体内环境。本研究采用人中性粒弹性蛋白酶诱导A549细胞24 h建立体外黏液高分泌细胞模型，模型组细胞MUC5AC基因与蛋白表达较空白组均显著升高，AQP5基因与蛋白表达较空白组均显著降低，与体内气道黏液高分泌病理模型相一致[16]。与模型组比较，金水六君煎组及养阴组主要在转录水平下调A549细胞MUC5AC mRNA表达，上调AQP5 mRNA表达。化痰组主要在翻译水平下调细胞MUC5AC蛋白表达，上调AQP5蛋白表达，提示金水六君煎不同成分之间具有不同的作用靶点。王志旺等[17-18]建立阴虚哮喘小鼠模型研究当归平喘作用，发现当归能促进小鼠肺组织AQP5表达，抑制MUC5AC的表达，通过调节肺组织水液代谢发挥平喘作用。邓青南、周建龙等[19-20]研究发现高浓度半夏提取物能通过抑制MUC5AC表达，上调AQP5表达抑制大鼠气道黏液高分泌状态。当归养阴润燥、半夏燥湿化痰可能是金水六君煎治疗气道黏液高分泌主要药效成分。

研究结果显示模型组细胞培养液中MUC5AC及AQP5蛋白表达较空白组无明显差异，提示黏蛋白、水通道蛋白合成及分泌过程并非成一致性改变。有研究认为人中性粒弹性蛋白酶诱导黏蛋白分泌至细胞外需激活蛋白酶激活受体2（PAR2）及蛋白激酶C（PKC）[21]。与模型组比较，金水六君煎组及养阴组培养液中AQP5明显增加，提示养阴成分可促进AQP5分泌至胞外，可解释金水六君煎组及养阴组细胞AQP5基因与蛋白水平表达不一致的原因，但具体机制还需要进一步研究。

综上，金水六君煎及其拆方含药血清可通过上调AQP5和抑制MUC5AC表达，改善HNE诱导的细胞黏液高分泌状态，为临床金水六君煎治疗COPD黏液高分泌提供临床指导。但金水六君煎及其拆方调控黏蛋白MUC5AC、水通道蛋白AQP5基因与蛋白表达的信号通路及MUC5AC与AQP5相互作用机制还需要进一步深入研究。

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