蛴螬提取物对视网膜静脉阻塞兔 内皮抑素表达的影响

梁凯霞 蒋鹏飞 彭俊 彭清华

〔摘要〕 目的 評价蛴螬提取物对兔视网膜静脉阻塞的治疗作用及其机制。方法 将40只兔随机分为4组：空白组、模型组、复方血栓通组、蛴螬组，每组10只兔20只眼，除空白组外，其余3组均用光化学动力法建立视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion， RVO）动物模型，于给药后1周、3周行FFA检查、HE染色、免疫组化观察内皮抑素表达。结果 FFA检查结果显示：给药后周1周，模型组中央静脉荧光渗漏、出血，复方血栓通组和蛴螬组渗漏、出血较模型组少;给药后3周，模型组渗漏、出血的静脉周围出现无灌注区，复方血栓通组渗漏、出血明显减小，蛴螬组渗漏、出血基本吸收。视网膜切片光镜观察结果显示：蛴螬组视网膜各层结构病理变化均轻于模型组、复方血栓通组。内皮抑素免疫组化结果显示：各造模组内皮抑素表达均下降，蛴螬组表达最强，模型组表达最弱，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 蛴螬提取物能改善视网膜缺血缺氧的状态，促进RVO模型中内皮抑素的表达。

〔关键词〕 视网膜静脉阻塞;蛴螬提取物;内皮抑素

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.03.005

Effect of Grub Extract on the Expression of Endostatin in Rabbits with Retinal Vein Occlusion

LIANG Kaixia1，2， JIANG Pengfei1，2， PENG Jun2，3， PENG Qinghua1，2，3*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 3. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine for Prevention and Treatment of Eye， Ear， Nose and Throat Diseases in Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To evaluate the therapeutic effect and mechanism of action of grub extract on rabbits with retinal vein occlusion （RVO）. Methods Forty rabbits were randomly and equally divided into blank group， model group， compound Xueshuantong group， and grub group， with 20 eyes in each group. A rabbit model of RVO was established by a photochemical kinetic method in all groups except for the blank group. Fluorescein fundus angiography （FFA）， HE staining， and immunohistochemistry （for measuring endostatin expression） were performed at 1 and 3 weeks after treatment. Results According to the FFA results， at 1 week after treatment， central venous fluorescence leakage and hemorrhage were observed in the model group; the compound Xueshuantong group and grub group had less leakage and hemorrhage than the model group. At 3 weeks after treatment， areas of non-perfusion showed up around the vein with leakage and hemorrhage in the model group; the compound Xueshuantong group had substantially reduced leakage and hemorrhage; the leakage and hemorrhage were almost absorbed in the grub group. The results of optical microscopic examination of retinal sections showed that the grub group had less pathological changes in each retina layer than the model group and the compound Xueshuantong group. According to the immunohistochemistry results， the expression of endostatin was significantly reduced in all three model establishment groups; among the three groups， the grub group had the highest expression of endostatin， while the model group had the lowest expression （P<0.05）. Conclusion Grub extract can improve retinal ischemia and hypoxia and promote the expression of endostatin in the rabbit model of RVO.

〔Keywords〕 retinal vein occlusion; grub extract; endostatin

视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion， RVO） 是临床上常见的眼底血管病，其病因复杂，一般认为高血压、高血脂、青光眼、糖尿病以及动脉硬化等都是高危因素[1]。RVO病程冗长，治疗困难，尚无特效疗法，RVO后视网膜组织会发生缺血缺氧，视网膜新生血管（retinal neovascularization， RNV）是RVO的常见并发症。蛴螬可治疗目疾，并有破血、行瘀、散结、明目之功效，前期研究发现蛴螬提取物可促进RVO出血的吸收、抑制RNV[2-3]，为明确其机制，本文通过建立RVO动物模型，探讨蛴螬对RNV的作用机制，为研究RVO和RNV的治疗提供方向。

1 材料

1.1  实验动物

选用40只健康实验性兔，雌雄兼用，体质量1.8～2.3 kg（合格证号：湘医动字第30-015号）。

1.2  主要药品和试剂

蛴螬提取物，制备参考阳长明的方法[4]。复方血栓通片（扬州中惠制药有限公司，规格：0.40 g×24片，批号090905）;25%乌拉坦（上海伊卡生物技术有限公司，批号：U0202）;20%荧光素钠（沈阳晟达化工有限公司，批号：SS00050）;一抗为兔抗内皮抑素多克隆抗体（武汉默沙克生物科技有限公司，批号：BA21646）。

1.3  主要仪器

JY0001型电子秤（上海天平仪器厂）;ZDS-10型勒克斯照度计（上海嘉定学联仪器厂）;YZZOT型显微镜（苏州医疗器械设备厂）;PCR仪（德国Biometra）;GelDoc XR+凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）;微量移液器（德国，eppendorf[1 mL/200 uL/10 uL）];台式高速冷冻离心机（Thermo）;DYCZ-24D垂直板电泳槽、DYCP-40C水平电转槽（北京六一仪器厂）;SP-752型紫外可见分光光度计（上海spectrum公司）。

2 方法

2.1  动物分组

通过随机数字表法将40只实验性兔随机分为空白组、模型组、复方血栓通组、蛴螬组，每组10只动物，20只眼。

2.2  造模方法

应用光化学动力法[5]制作实验性RVO模型，模型组、复方血栓通组、蛴螬组双眼散瞳后，麻醉动物，固定兔于裂隙灯前，安置三面镜。激光器指示光斑定位于视盘边缘的静脉后，自耳缘静脉缓慢推入20%荧光素钠注射液（0.3 mL/kg），30 s内推完。在注药后，用倍频Nd：YAG激光对双侧视网膜静脉进行照射，同时避开伴行的动脉，看到有明显的远端静脉扩张时停止。

2.3  动物给药方法

造模成功后第1天开始给药，空白组、模型组生理盐水5 mL/kg灌胃;复方血栓通组：复方血栓通0.1 g/kg溶于生理盐水中制成混悬剂，5 mL/kg灌胃;蛴螬组：蛴螬水提取物1.5 mL/kg灌胃，其中1 mL水提物相当于1 g生药量。各组均为每日1次，持续3周，于给药后1周、3周每组各随机处死5只动物。

2.4  取材方法

动物耳缘静脉注射空气处死后，立即摘除眼球（包括球后视神经2 mm），于角膜缘后0.5 mm处剪开眼球壁，去除眼前节组织和玻璃体，将眼球壁在手术显微镜下剥离激光斑部位视网膜，逐级酒精脱水，常规石蜡包埋，经视乳头颜侧旁开1 mm纵向做4 μm厚的切片，烘干备用。

2.5  荧光素眼底血管造影（fluorescein fundus angiograpny， FFA）

给药后1周、3周对兔行FFA检查，将1周和3周的FFA结果，应用Mias-2000型显微图像分析系统自动测量无灌注区（non perfusion area， NPA）和视盘（optic disk， OD）的面积并求出比值（S=N/D）[6]。分为有无灌注区、无新生血管（甲类）和有无灌注区、有新生血管（乙类）。

2.6  光镜观察

将取材的切片行苏木精-伊红染色，做免疫组化组织学检测内皮抑素表达：于40×目镜下观察，每张切片均选取免疫组化阳性染色最多的4个视野框，用Mias-2000图形分析系统行视网膜色素上皮以上测量框内染成棕黄色的ES的平均光密度，在光学显微镜下主要观察视网膜组织变化。

2.7  统计学处理

采用SPSS 21.0软件进行分析。多组比较用单因素方差分析，组间两两比较用q检验（S-N-K法），组内不同时间点比较采用重复测量资料的方差分析，相关性分析用Bivariate分析。各项指标均以“x±s”表示。P<0.05被认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1  FFA检查结果

给药后1周，模型组中央静脉荧光渗漏、出血，复方血栓通组、蛴螬组渗漏、出血较模型组少（P<0.05）;给药后3周，模型组渗漏、出血的静脉周围出现无灌注区，复方血栓通组渗漏、出血明显减小，蛴螬组与模型组相比，渗漏、出血基本吸收，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3.2  HE染色结果

空白组：视网膜各层结构清晰，排列正常。模型组：给药后1周，视网膜组织水肿，细胞排列较乱，尚无新生血管索;给药后3周，出现大量地新生血管索。复方血栓通组：给药后1周，视网膜组织水肿，细胞排列紊乱;给药后3周，视网膜组织水肿减輕，无新生血管索。蛴螬组：给药后1周，视网膜组织细胞排列大致清晰;给药后3周，视网膜组织水肿减轻，无新生血管索。见图1。

3.3  內皮抑素的阳性表达结果

与空白组比较，模型组内皮抑素表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。给药后第1周：模型组、复方血栓通组、蛴螬组视网膜组织中均可见棕色颗粒状染色，其中蛴螬组内皮抑素表达最强，模型组内皮抑素表达最弱，差异有统计学意义（P<0.05）;给药后3周：蛴螬组视网膜组织中内皮抑素表达最强;复方血栓通组内皮抑素表达均较蛴螬组稍弱;蛴螬提取物组3周与1周比较，内皮抑素表达明显减弱（P<0.05）。见表2。

4 讨论

RVO发病率高，是仅次于糖尿病视网膜病变的第二大致盲性视网膜血管病[7-9]，其发生机制目前尚不明了[10-13]。

蛴螬是金龟子的幼虫，首次记载于《神农本草经》：“主恶血血瘀痹气，破折血在胁下坚满痛，月闭，目中淫肤，青翳白膜。”《本草纲目》中记载此药味咸微温，有破血、行瘀、散结、通乳、解毒、消疮、明目的功能。现代药理研究认为蛴螬对视网膜静脉阻塞的缺血视网膜组织有保护作用[2-3]，能够治疗RVO所致的视网膜病理损伤。

内皮抑素是内源性血管生成抑制因子[14]，能够特异性的抑制血管内皮细胞增殖、迁移和凋亡。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促进血管内皮细胞分裂，通过与膜受体结合特异性调节内皮细胞增殖，促进新生血管生成[15]，视网膜新生血管是视网膜静脉阻塞的主要并发症之一，影响着视网膜静脉阻塞的治疗与预后。内皮抑素可竞争性抑制VEGF与其膜受体的结合，阻断VEGF受体活化的信号转导通路，抑制VEGF介导的血管内皮细胞迁移和新生血管的形成。

本研究结果显示：模型组内皮抑素阳性表达高于空白组，二者差异有统计学意义。据此推断，光化学法建立RVO模型产生的RNV，其发生机制与内皮抑素密切相关，复方血栓通治疗组、蛴螬提取物治疗组的内皮抑素较模型组均有增多，提示复方血栓通治疗组、蛴螬提取物治疗组是通过上调内皮抑素的表达抑制血管内皮生长因子在视网膜组织中的表达，从而抑制了RNV的发生。

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