液相色谱-串联质谱法同时测定丹参中139种农药残留

2019-09-10李雯婷苗水陈铭周恒兰岚毛秀红季申

世界中医药 2019年4期

李雯婷　苗水　陈铭　周恒　兰岚　毛秀红　季申

摘要目的：采用液相色谱-串联质谱法建立丹参中农药多残留的测定方法。方法：样品经改良的QuEChERS方法提取，采用分散固相萃取（d-SPE）二次净化法净化，并采用液相色谱-串联质谱技术在多反应监测（MRM）模式下测定，内标法定量。结果：丹参中139种农药在0.005～0.2 mg/L范围内线性关系均良好;在10、50和100 μg/kg添加水平下，除了噻菌灵回收率偏低（67.2～67.9）外，其余农药的平均回收率为70.2%～126.1%，相对标准偏差（RSD）为1.2%～19.5%，139种农药的检测限为0.005～0.05 mg/kg。结论：该方法样品前处理简单快速，灵敏度、准确度和精密度均符合农药多残留检测技术的要求，适用于丹参中139种农药残留的快速筛查测定。

关键词液相色谱-串联质谱法;农药残留;QuEChERS法;丹参;分散固相萃取;固相萃取;盐析剂;匀浆法

Simultaneous Determination of 139 Pesticide Residues in Salvia miltiorrhiza by LC-MS/MS

Li Wenting，Miao Shui，Chen Ming，Zhou Heng，Lan Lan，Mao Xiuhong，Ji Shen

（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

Abstract Objective：To study the multi-residues detection methods for Salvia miltiorrhiza by LC-MS/MS.Methods：A method using a modified QuEChERS and d-SPE clean-up followed by LC-MS/MS has been established for the quantitative determination of the residues.The extract was determined by LC-MS/MS in multi-reaction monitoring（MRM）mode，and internal standard method was applied to quantify the pesticides.Results：All the 139 pesticides showed good linearity in the range of 0.005～0.2 mg/L.The average recoveries of the pesticides at the spiked levels of 10，50，100 μg/kg ranged from 70.2～126.1% with the RSDs of 1.2～19.5%，except for Thiabendazole（67.2～67.9%）.The limits of detection（LODs）of 139 pesticides were 0.005～0.05 mg/kg.The results demonstrated that this method was simple，rapid and suitable for the determination of 139 pesticide residues in Salvia miltiorrhiza.Conclusion：The analytical sensitivity and accuracy can meet the requirements of multiple pesticide residue analysis.

Key Words LC-MS/MS; Pesticide residues; QuEChERS; Salvia miltiorrhiza; dSPE; SPE; Salting-out agent; Homogenate

中图分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.001

丹参（Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma）为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根茎，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除煩，凉血消痈的功效[1]。临床应用范围广泛，属于大宗常用中药材。在丹参大规模人工种植情况下，农药的使用是保障丹参产量与质量的重要手段。但随着农药的广泛使用，丹参农药残留问题日趋严重，直接影响了人民用药的安全性和有效性，也是制约中药走向国际市场的瓶颈。因此，建立简便、高效的丹参中农药多残留检测方法，对保证用药安全及推进中药现代化、国际化具有重要的意义。

农药多残留分析亟需解决的主要问题之一是去除基质干扰对于残留农药定量准确度、灵敏度及仪器污染的影响。因此，前处理中净化方法的选择和优化是农药多残留检测的关键。目前，常用的前处理技术主要包括固相分散萃取[2-4]、固相微萃取[5]、凝胶渗透色谱[6]以及QuEChERS[7-8]等。而QuEChERS法以其快速、简便、高效、安全等特点，已广泛应用于中药材农药多残留分析，是当前国内外实验室普遍采用的前处理方法。

仪器检测方法主要有气相色谱法（GC）[9-11]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[12-13]、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）[14-17]、液相色谱-质谱法（LC-MS）[18]以及液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[19-22]等。常用的色谱法由于检测器的局限，多农药筛查能力较弱;且由于丹参基质的干扰，无法通过保留时间定性定量，易产生假阳性和假阴性的结果。GC-MS和LC-MS被广泛应用于农药多残留检测中，但2种检测方法对于几百种农药的多残留检测需建立多个检测方法，样品需反复测定，耗时耗力;且在选择离子检测（SIM）模式下采集的质谱信息少，选择性较差，结果存在较大的不确定性。液相色谱-三重四极杆串联质谱通过其高通量的离子传输性能，在高选择性的多反应监测（MRM）模式下可实现一次进样同时分析百余种化合物，且基质干扰少，能有效减少和避免假阳性和假阴性的现象，是中药材农药多残留检测的必然选择。丹参中存在大量的脂溶性色素和水溶性酚酸等，对农药残留测定干扰大。本文以改良的QuEChERS法提取，采用分散固相萃取（d-SPE）二次净化法净化，并采用LC-MS/MS在MRM模式下进行测定，内标法定量，快速准确地测定了丹参中139种农药残留。该方法具有操作简便、灵敏度高、应用广泛等特点，对丹参药材的安全监测有重要的意义。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290超高效液相色谱仪（美国Agilent公司），AB SCIEX 5500三重四极杆质谱仪（美国AB SCIEX公司），旋转蒸发仪（瑞士BüCHI公司），N-EVAPTM 112型氮吹仪（美国Organomation公司），匀浆机（上海Fluko公司），IKA KS260C振荡器（德国IKA公司），VisiprepTM DL固相萃取装置（美国Supelco公司），IKA MS 2涡旋混合器（德国IKA公司），UV2550（日本岛津公司）

1.2 试剂与材料

139种农药标准品（Dr.Ehrenstorfer GmbHr公司或Chem Service公司）;乙腈、甲醇、丙酮、乙酸均为色谱纯;无水醋酸钠，无水硫酸镁为分析纯;C18固相萃取柱（400 mg/6 mL）、石墨化碳：乙二胺-N-丙基硅烷混合型固相萃取柱（PC/PSA-SPE）（400 mg：400 mg/6 mL）;吸附剂：N-丙基乙二胺（PSA）、弗罗里硅土（Florisl）、石墨化炭黑（GCB）、十八烷基键合硅胶（C18）、硅胶（Silica）、Chlorofiltr均购于天津博纳艾杰尔科技有限公司;丹参药材均购于上海华宇药业。

1.3 分析样品

实验用丹参样品分别来源于上海华宇药业有限公司、上海养和堂中药饮片有限公司、上海中西制药有限公司共9批，依次编号为1～9。

2 方法与结果

2.1 LC-MS/MS色谱质谱条件

色谱条件：色谱柱：Agilent SB-C18（3.5 μm，2.1×150 mm）;流动相：A相，0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸钠水溶液;B相，乙腈。梯度洗脱程序：0～15.00 min，75% A～10% A;15.00～20.00 min，10% A～10% A;20.00～28.00 min，75% A～25% A。流速：0.40 mL/min;进样量：2.0 μL。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）;扫描方式：正离子扫描;检测方式：多反应监测（MRM）模式;电喷雾电压：5 500 V;雾化气压力：50.0 psi;辅助气压力：50.0 psi;气帘气压力：20.0 psi;碰撞气压力：7.0 psi;离子源温度：500 ℃;扫描时间：50 ms;碰撞室入口电压：10 V;碰撞室出口电压：12 V;监测离子对及其相关质谱参数见表1。按照上述LC-MS/MS条件所得139种农药MRM图谱见图1。

2.2 标准品溶液的配制

标准品储备溶液的制备：精密称取各农药对照品适量，根据各农药溶解性加乙腈或甲苯分别制成每1 mL中含1 000 μg的溶液，即得，贮存在4 ℃冰箱中备用。

内标储备溶液的制备：精密称取氘代莠去津（Atrazine-d5）标准品适量，加乙腈溶解并制成每1 mL含1 000 μg的溶液，即得。

混合标准品溶液的制备：精密量取上述标准品储备液适量，用含0.05%醋酸的乙腈分别制成每1 mL含100 μg和 1 000 μg的2种溶液，即得。

内标溶液的制备：精密量取内标储备溶液适量，加乙腈制成每1 mL含6 μg的溶液，即得。

基质混合标准品工作溶液的制备：取丹参空白基质样品3 g，一式6份，同供试品溶液的制备方法处理至“吸取上清液0.5 mL”，置氮吹仪上于40 ℃水浴浓缩至约0.2 mL，分别加入混合标准品溶液（100 μg/L）25 μL、50 μL，混合标准品溶液（1 000 μg/L）25 μL、50 μL、100 μL、200 μL，加乙腈定容至0.5 mL，涡旋混匀，用微孔滤膜滤过（0.22 μm），取续滤液，即得系列基质混合标准品工作溶液。

2.3 供试品制备方法

提取：取供试品，粉碎成粉末（过三号筛），取约3 g（精确至0.01 g），置50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，涡旋使药粉充分浸润，放置30 min，精密加入乙腈15 mL与内标溶液100 μL，涡旋使混匀，置振荡器上剧烈振荡（500次/min）5 min，加入无水硫酸镁与无水醋酸钠的混合粉末（4∶1）7.5 g，立即摇散，再置振荡器上剧烈震荡（500次/min）3 min，于冰浴中冷却10 min，离心（4 000 r/min）5 min，待净化。

净化：精密移取上清液9 mL置已预先装有净化材料的分散固相萃取净化管（弗罗里硅土300 mg，十八烷基键合硅胶300 mg，N-丙基乙二胺600 mg，石墨化炭黑150 mg，无水硫酸镁900 mg）中，涡旋使充分混匀，再置振荡器上剧烈震荡（500次/min）5 min使净化完全，离心（4 000 r/min）5 min，精密吸取上清液5 mL，置氮吹仪上于40 ℃水浴浓缩至约0.4 mL，加乙腈定容至1 mL，涡旋使混匀，加入N-丙基乙二胺50 mg、无水硫酸镁150 mg，涡旋60 s使凈化完全，离心（4 000 r/min）5 min，取上清液0.5 mL，涡旋混匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性范围和检出限

按照“2.2”项下的方法配置基质标准溶液，进行测定。以各组分的质量浓度为横坐标（X），各组分的峰面积与内标峰面积比为纵坐标（Y），进行回归分析，结果见表2。139种农药在0.005～0.2 mg/kg线性范围内线性关系良好，相关系数（r）均≥0.99。采用在空白丹参基质中添加较低浓度水平的混合标准品溶液的方法，确定各农药在丹参基质中的最低检出限，本实验是以实际看到峰的最低浓度作为检出限，检出限结果见表2，从表2可得约90%农药的检出限可到达0.005 mg/kg，说明方法的灵敏度高。

2.5 回收率和精密度

将混合标准品储备溶液添加到丹参空白基质中，分别制成质量浓度为10、50、100 μg/kg的加标样品溶液，以“1.3”所述方法进行前处理，一式6份，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。3个加标水平下，除了噻菌灵回收率偏低（67.2～67.9），其余农药的平均回收率为70.2%～126.1%，RSD为1.2%～19.5%，数据表明该方法具有良好的适用性，回收率满足农药残留检测要求。

2.6 样品测定结果

采用所建立的分析方法对9批丹参药材进行农药残留检测，样品测定结果见表3。

3 讨论

3.1 检测农药品种的选择根据我国中药材中农药的施用情况，并参照国内外农药残留监测动向，依据以下原则选择检测农药的品种：国内国际禁限用农药品种的名单;在我国有关部门登记常用农药中毒性较大，对人类存在“三致”危险的农药;我国食品国家标准（GB）中监控的农药，且毒性较大的农药;美国、欧洲等各国药典针对植物药的农药残留监控的品种。根据以上原则筛选的农药品种再结合液相色谱串联质谱分析的特点，最终选择检测农药为139种。

3.2 提取方法的优化

3.2.1 提取方式的选择选用丹参阳性样品（检出多菌灵），分别采用加水浸泡后提取的改良QuEChERS法与直接用乙腈提取的匀浆法提取，实验发现改良QuEChERS法的药材溶胀率为匀浆法的3倍左右，且改良QuEChERS法的提取效率明显高于匀浆法，这是由于中药材丹参含水量较少，直接使用有机溶剂难以有效提取目标分析物;而加水溶胀后提取溶剂可渗入细胞及组织内部，提高提取效率，故最终采用改良QuEChERS法提取。

3.2.2 提取溶剂的选择目前，农药多残留检测常用的提取溶剂有乙酸乙酯、丙酮和乙腈。乙酸乙酯由于与水不互溶，不易渗入植物细胞，不利于农药萃出。本研究比较了丙酮、乙腈2种提取溶剂，结果显示（图2），丙酮提取液的颜色远深于乙腈，说明提取液中共萃物的杂质较多，对后续净化与分析过程产生不利影响，且丙酮的沸点较低，易于挥发，提取时易造成提取溶剂的体积变化;而乙腈适合的农药极性范围较广，可以有效萃取丹参中的农药残留同时减少糖类、色素与脂肪类成分等共萃物的提取，故而选用乙腈作为提取溶剂。

3.2.3 浸泡时间的考察本实验考察了不同浸泡时间对提取效率的影响。选用丹参阳性样品（检出多菌灵）加水分别浸泡0.5、1、3 h，然后加乙腈振荡提取。结果可见，不同浸泡时间对于阳性样品表现出一致的提取效率，说明浸泡0.5 h即可将残留农药提取完全，故最终确定浸泡时间为0.5 h。

3.2.4 盐析剂的选择 QuEChERS法中盐析剂的使用可以促进目标化合物由水相分配至有机相中。本实验比较了NaCl和NaAc 2种盐析剂，实验发现2种盐析剂对农药回收率的影响没有明显的区别，平均回收率分别为102.7%和98.3%。但在提取液中加入NaAc，可以使提取液形成HAc-NaAc缓冲系统，保证萃取液的pH值稳定在4～5之间，从而减少或防止在碱性或中性环境中不稳定农药的降解，提高了方法的适用范围;且采用NaAc作为盐析剂的提取液颜色明显浅于NaCl（图2），说明其中色素等共提取较少，故最终选择NaAc作为盐析剂。

3.3 净化条件的优化

3.3.1 净化方法的选择

目前，农药多残留的常用净化方法有固相萃取法（SPE）和分散固相萃取法（d-SPE）。本实验比较了固相萃取法（C18柱/500 mg、GCB/PSA串联柱/400 mg/400 mg/）、一次分散固相萃取净化法（Florisl/300 mg、C18/300 mg、PSA/300 mg、GCB/150 mg、无水硫酸镁/900 mg）、二次分散固相萃取净化法（①Florisl/300 mg、C18/300 mg、PSA/300 mg、GCB/150 mg、无水硫酸镁/900 mg②PSA50 mg，无水硫酸镁150 mg）。通过比较净化液的颜色深浅来评价净化效果，实验发现二次d-SPE净化法效果最佳，SPE法次之，一次d-SPE净化法稍差;并且二次d-SPE法较SPE法操作简便，重复性好，溶剂用量少，耗时短，故本实验选择二次d-SPE净化法作为净化方法。

3.3.2 净化材料的优选

3.3.2.1 一次净化材料的选择

针对丹参基质主要含有脂溶性色素类、水溶性酚酸类、黄酮类、三萜类和甾醇类等干扰成分。本实验比较了C18、PSA、Florisl、Silica、GCB和Chlorofiltr等六种净化材料。其中GCB与Chlorofiltr均可用于除去基质中的色素类杂质，但GCB的净化效果明显好于Chlorofiltr，且用量较少，故选择GCB作为净化材料;Florisl和Silica均可用于除去羟基类及含杂原子或杂環化合物的极性干扰物，但Florisl的净化效果较好，故选择Florisl作为净化材料;C18可去除丹参基质中的脂类和甾醇类干扰成分;PSA可去除与GCB不同的有机酸和极性色素类干扰成分。故最终优选GCB、C18、PSA及Florisl作为净化材料，4种净化材料具有不同的净化机理，一次净化，可去除多种干扰成分。

3.3.2.2 二次净化材料的选择

针对丹参中色素类干扰成分多的特点，选择了GCB、PSA和Florisl 3种净化材料进行考察，实验发现GCB/15 mg与PSA/50 mg净化效果相当，Florisl/50 mg稍差;由于GCB对个别含平面及对称结构的农药有一定的吸附作用，故最终选择PSA/50 mg作为二次净化的净化材料。

3.3.3 净化材料配比的考察

3.3.3.1 GCB用量的考察

GCB虽然可以有效地去除色素，但由于其表面的正六元环结构会吸附一些平面及对称结构的农药（如多菌灵、蝇毒磷、嘧菌环胺、噻菌灵、三环唑等），导致这些组分回收率降低。所以GCB用量要根据基质所含色素干扰成分的多少决定，使其既能起到净化作用又不降低这类农药的回收率。本实验对不同用量的GCB进行了考察，由图3可见多菌灵、蝇毒磷等5种农药随着GCB用量的增加，回收率逐渐减小;当GCB用量为150 mg时，回收率符合要求，所以确定GCB的用量为150 mg。

3.3.3.2 PSA、C18、Florisl用量的考察

在石墨化炭黑用量确定的基础上，对PSA、C18和Florisl 3种净化材料的用量进行考察。采用紫外光谱扫描，分别比较了3种净化材料的用量为300 mg、600 mg、900 mg时的净化效果，实验发现随着Florisl、C18用量的增加，对丹参提取液的净化效果没有明显的提升;而随着PSA用量的增加，对丹参提取液的净化效果提升明显，故确定增加PSA的用量。

考察了PSA的用量对农药回收率的影响，实验发现增大PSA用量，虽然净化效果明显，但对部分农药的回收率产生影响，不能满足检测要求;而当PSA用量为600 mg时，各农药的回收率最佳，因此最终确定净化材料的配比为Florisl/300 mg，C18/300 mg，PSA/600 mg，GCB/150 mg，无水硫酸镁/900 mg。

3.4 基质效应的评价

基质效应是指基质中共提取干扰物影响目标化合物的离子化，从而使化合物在仪器上的响应发生增强或抑制。因此，需要对目标化合物的基质效应进行评价，并根据评价结果选择适合的方法对基质效应进行抵消。本试验通过测定溶剂标准溶液和基质标准溶液，分别建立标准曲线，比较两条标准曲线斜率的差异，从而判断基质效应的强弱，计算公式如下：基质效应=[（基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率）-1]×100%。实验发现，139种农药中，仅16种农药的基质效应不明显（±30%），其余123种农药均产生中等和较强的基质抑制效应（<-30%）。由于基质抑制效应明显，最终采用基质匹配内标标准曲线法对样品中的农药残留进行定量，以抵消基质效应的影响。

3.5 丹参检测结果分析

9批丹参药材中有7批检出1～2种农药，检出率为78%;检出农药分别为多菌灵、吡虫啉、啶虫脒;且有6批药材均检出多菌灵，提示多菌灵为丹参种植常用农药，需加强丹参中多菌灵的监测。

本研究采用改良的QuEChERS提取，针对丹参基质研发的二次分散固相萃取法净化，建立了液相色谱-串联质谱同时测定丹参中139种农药残留的分析方法。该方法样品前处理简单，灵敏度、准确性均能满足农药残留检测要求，为中药材丹参中多类别农药残留的快速筛查、风险评估等研究提供了一种高效、可靠的分析手段。

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