液相色谱校准曲线法检测药物残留时不确定度的评估与分析

2019-09-10方强丁成黄芳章雪明

粮食科技与经济 2019年4期

方强　丁成　黄芳　章雪明

[摘要]本文从检测全过程及仪器定量原理的角度出发，评估了液相色谱法测定鲈鱼中3种喹诺酮类药物残留时的不确定度。研究结果表明，诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星3类参数校正点相对不确定度分别占合成相对标准不确定度的5.6%、34.2%、1.7%;药物残留含量计算值相对不确定度分别占合成相对不确定度的4.9%、22.9%、18.0%;回收率引入相对不确定度分别占合成相对不确定度的89.4%、42.9%、80.3%。

[关键词]液相色谱校准曲线法;检测药物残留;不确定度

中图分类号：TS207

文献标识码：A

DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20190408

药物残留检验系符合性检验，当测试结果处于规定指标临界值附近时，测量不确定度对判断结果符合性会产生影响。2016年1月1日实施的《检验检测机构资质认定评审准则》明确提出了不确定度的要求，准确评估测量不确定度对药物残留检验检测机构具有重要意义。

药物残留的检验检测通常具有较为复杂的前处理过程，进而使检验检测的结果出现误差。规范相关的检验检测标准虽然会给出回收率允许的参考范围，但是一般都未要求对范围内的非100%回收进行校正，误差就转化为测量不确定度。

本文从一般残留试验全过程及仪器定量原理的角度出发，参考汪辉等药物残留不确定度评估方法，解析了液相色谱校准曲线法检测药物残留时不确定度的来源，并以鲈鱼中3种喹诺酮类药物残留为例，按GUM法评估了测量不确定度，为同类型的药物残留检验提供了一定的参考作用。

1药物残留检测一般过程

药物残留检测一般过程见图1。

2测量模型和不确定度来源

2.1测量模型

试样中药物残留计算公式：

（1）标准储备液浓度

（2）高浓度标准使用液浓度

（3）低浓度标准使用液浓度

由公式（1）和公式（2）可得校准曲线高浓度的3个点：

由公式（11）和公式（3）可得低浓度的3个点：

（4）校准曲线线性回归方程

（5）试样测定浓度

（6）试样含量计算值

（7）阳性添加样品添加含量

（8）回收率

（9）试样真实含量

式中：C储为标准储备液浓度，μg/mL;m标为标准品称样量，g;P为标准品的纯度;MW为纯物质分子量;MW2为带其他基团后的分子量;V容1为标准储备液定容体积，mL;e使为高浓度标准使用液的浓度，μg/mL;V移1为移取标准储备液的体积，mL;V容2为高浓度标准使用液的定容体积，mL;c'使为低浓度标准使用液浓度，μg/mL;V'移1为移取高浓度使用液配制低浓度使用的体积，mL;V'容2为低浓度标准使用液的定容体积，mL;C点为校准曲线各点的浓度，ng/mL;V移2为校准曲线各点移取的标准使用液的体积，μL;V容3为校准曲线各点的定容体积，mL;y为峰面积;a为校正曲线的截距;b为斜率;V容4为测定液的定容体积，mL;V移了为阳性添加样品加标体积;X因为阳性样品添加含量;X为试样药物残留的含量;fp为平均回收率和期望值100%偏差的校正因子;fg为校正曲线配制过程中校正点误差校正因子。

2.2不确定度来源

由公式（11）可知，不确定度的来源包括含量计算值的不确定度、回收率的不确定度和校正点的不确定度。

3鲈鱼中3种喹诺酮类药物残留测定时不确定度评定

3.1实验

3.1.1材料与试剂

试验样品为鲈鱼;诺氟沙星（Nor）、盐酸环丙沙星（Cip）、恩诺沙星（Enr）标准储备液均由Dr.Ehrenstorfer公司的固体标准品配制而成;盐酸、无水硫酸钠（经650C灼烧烘干）为分析纯;乙腈、正已烷、磷酸、三乙胺为色谱纯试剂;酸化乙腈（乙腈：盐酸=250：1）;0.34%磷酸水溶液（经三乙胺调节pH值至2.4）;试验用水均符合GB/T6682-2008131-级水的要求。

3.1.2仪器与设备

e2695液相色谱仪、2489荧光检测器：美国Waters公司;BSA2202S-CW百分之一电子天平、十万分之一电子天平：德国赛多利斯公司;XcelVap自动浓缩工作站：美国Horizon公司;0.2μmx13mmNYL慮头：英国Whatman公司。

3.1.3标准储备液及校正曲线配制

分别称取0.00503g的Nor、0.00582g的Cip.0.00504g的Enr固体标准物质于3个50mL容量瓶中，用2%甲酸一甲醇溶液溶解定容，浓度均为100μg/mL。分别吸取Nor和Enr标准储备液各5mL、Cip标准储备液1mL于50mL容量瓶中，用流动相定容得Nor和Enr浓度为10μg/mL、Cip浓度为2μg/mL的混合标准工作液;吸取该混合标准工作液200μL于5mL指形管中，用1mL移液枪分2次吸取900μL流动相定容，得Nor和Enr浓度为1.0μg/mL.Cip浓度为0.20μg/mL的混合标准工作液。

分别移取上述浓度的混合标准工作液各25μL、50μL、100μL于6个2mL进样瓶中，用1mL移液枪移取流动相定容至1mL，得Nor和Enr浓度为25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL，Cip浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的校准溶液系列。

所用容量瓶为A级硼硅玻璃。流动相的水温为21～25%C。3种喹诺酮类药物校正曲线回归方程如下：（1）Nor：y=145596x+2638353，r=0.999899，其中y为峰面积，x为浓度，斜率b=145596，截距a=2638353。（2）Enr：y=220610x+9215728，r=0.999878，其中y为峰面积，x为浓度，斜率b=220610，截距a=9215728。（3）Cip：y=121276x+398669，r=0.999855，其中y为峰面积，x为浓度，斜率b=121276，截距a=398669。

3.1.4样品处理及测定

阴性对照样品和阳性添加样品各7个重复，阳性添加样品加人0.15mL的Nor和Enr浓度为1.0μg/mL、Cip浓度为0.20μg/mL的混合标准工作液作为阳性添加试验。

（1）前处理。称取5g样品，置于50mL离心管中，加入6g无水硫酸钠，25mL酸化乙腈，振摇10min，8000r/min离心5min，取上清液，氮吹至干，1mL流动相定容，3mL正已烷抽脂，下层液过滤头待测。

（2）测定。本次测定采用校正曲线法定量，流动相为乙腈和0.34%磷酸一水溶液（15：85）的混合溶液。色谱柱：WatersXBridgeC184.6μmx250mm;流速：1.0mL/min;柱温：35%C;进样量：20μL;进样时间：30min;激发波长：280nm;发射波长：450nm。

（3）数据。方法偏差试验结果见表1。

（4）数据检验。采用Grubbs检验法对表1数据进行检验，经检验，数据均无异常。

3.2不确定度评定

3.2.1校正点的相对标准不确定度

本文所用校正曲线的6个点中，低浓度3个点较高浓度3个点多一步稀释，故低浓度点的不确定度应大于高浓度点，本文取低浓度点中不确定度最大点作为校正点的不确定度。根据公式（5）可得校正点的相对标准不确定度：

因V'容2和V。容3的定容实际为一个移液过程，V移1和V称2引人的不确定度可包含在V容2和V容3中，则：

本文所用Cip标准品带盐酸基团，故应计算MW引人的不确定度，其余标准品为纯物质，不需要考虑（取均匀分布k=√3）。查元素周期表（2005年）计算后得：u（MW|）2=3.7573x10-6

标准品称量引入的相对标准不确定度u2（m标）见表2。十万之一天平称量5g以下时允差为+0.5e，本文采用减量法称量标准品，取三角分布，故：

式中：m标表示各标准品称样量，go标准品纯度P引入的相对标准定度：

查标准物质证书：Py;99.1%，Uo=1.0%（k=2）;Pem=99.1%，Up=1.0%（k=2）;Pcar=94.0%，Ucn=1.0%（k=2）。则有Nor：u（P）=0.5，u（P）=2.546x10～;Enr：u（P）=0.5，12（P）=2.551x10～;Cip：.u（P）=0.5，u（P）=2.829x10～。

构成体积V不确定度u（V）主要分量有3个：量器示值偏差引人的不确定度u（AV示），配制溶液时溶液温度偏离标准温度引人的工标体积差不确定度u（AV工），使用溶液时的液温偏离配制溶液时的液温引人的温变体积差不确定度u（AV;温）。本试验室有中央控温系统，且在同一天完成，查当日的温度监控记录，温度变化为21～25%C。

u2（V）=u2（AV示）+u2（AV⊥）+u？（AV温）（21）（1）量器示值偏差的不确定度u（AV示）。查JJG646-2006/41和JJG196-200651得到所用量器的容量V，允差，取三角分布，k=√6，示值偏差引人的标准不确定度见表3。

（2）工标体积差的不确定度Iu（（△V工）。由于水、甲醇和乙腈的密度随温度变化呈非线性，用体积膨胀法计算温度变动导致甲醇溶液和水-乙腈混合溶液（流动相）的体积变化是不合适的。根据密度定义式推导出体积变化算式，再用密度修正值代替密度值便可进行准确计算。其中，乙腈-水的密度随温度变化表没有查到，参考甲醇-水的密度变化表。K（t）根据JJG646-200641和JJG196-200651计算公式得到。容量瓶为硅硼玻璃，取三角分布。根据使用的量器和液体种类的不同，代人公式计算后，工标体积误差不确定度见表4。

（3）温变体积误差的不确定度见表5。

（4）体积V不确定度u（V）合成。根据定容或移液的体积、量器的材质以及液体种类计算，结果见表6。

（5）计算浓度和期望浓度误差引人的不确定度。试验过程中标准曲线的计算浓度和期望浓度是有差异的，但为了方便计算、本文直接以期望浓度赋予各校正點浓度，根据经验该行为引人的相对标准不确定度在最低浓度点最大，故代人公式计算后（取均匀分布），数据见表7。

3.2.2药物残留含量计算值引入的相对标准不确定度

药物残留含量计算值引入的相对标准不确定度：

测定浓度引入的相对标准不确定度：

式中：S成为校正曲线的残余偏差;p为试验重复次数;n;为校正曲线的点数;文校为校正曲线各浓度点数值的平均值;x;为校正曲线各点的浓度值;y;为校正曲线个点的峰面积;c为测定浓度的平均值。

将数据代人公式，得Nor：S残=8.712x10';Enr：s残=1.448x10*;Cip：sa=5.166x10'。Nor：u（c测）=3.616，un2（C测）=0.02958;Enr：u（c测）=3.877，Urel（C测）=0.02514;Cip：u（c测）=2.602，uu（c测）=0.1201。

（2）u2（Vw4）的计算。V容4定容实际为一个移液过程，且3类化合物的不确定度都相同，故u2（V容4）=1.757x10～。

（3）称量试样时引人的不确定度：

式中：m样为称样量，m样为阴性对照样品和阳性添加样品称样量的平均值，为5.00g。百分之一天平允差为+0.5e，取三角分布，则：u2（m样）=（0.05+√6）2=8.333x10+，u2（m程）=1.67x10-

（4）仪器引人的相对标准不确定度。液相色谱重复定量测定RSD≤3%（本文取3%），根据A类标准不确定度的计算公式可得仪器引人的相对标准不确定度：u2（f仪器）=（0.03+√6）2=1.5x10-2

（5）u2（X计）的合成。Nor：u2（X计）=1.05x10*;Enr：u（X计）=8.16x10*;Gip：u（X）=1.46x10-2。

3.2.3回收率引入的相对不确定度

回收率引人的相对不确定度：

（1）回收率与期望值差异引人的相对标准不确定度。对各参数的回收率进行显著性检验，其中：

式中：S回收率为回收率的标准偏差，R为回收率的平均值，R。为回收率期望值（R.=100%），t为置信因子。结果表明，Nor、Cip的回收率与期望值存在显著性差异，即引人了不确定度;Enr不存在显著性差异，即引人的不确定度可忽略。计算数据取均匀分布，结果见表8。

（2）阴性和阳性对照样品在回收率计算中引人的相对标准不确定度Uuea（X阴）和un2（X阳）。阴性对照样品参数含量值接近0，本文认为其不确定度为仪器的不确定度，2（Xp）+u2（f仪器）=1.5x10+。阳性添加样品uoa（Xp）与un（X+）是相同的，Nor：u2（Xq）=1.05x10～;Enr：品（X阳）=8.16x10*;Cip：疏（X阳）=1.46x10～。

（3）添加含量引入的相对标准不确定度。根据公式（9）可得：

（4）回收率重复性引人的相对不确定度。将表8中的R、S回收率代人公式：

3.2.4相对标准不确定度的合成

4结论

（1）Nor、Enr、Cip（以下数据如无特殊说明均按此顺序排列）3个参数校正点相对不确定度分别占合成相对标准不确定度的5.6%、34.2%、1.7%;药物残留含量计算值相对不确定度分别占合成相对不确定度的4.9%、22.9%、18.0%;回收率引入相对不确定度分别占合成相对不确定度的89.4%、42.9%、80.3%。因标准物质带有非目标的基团而引人的相对标准不确定度较小，可忽略不计，因移液、定容等体积因素引入的相对不确定度占校正点相对不确定度分别为96.7%、96.7%、86.9%，其中因V容3-Iml，引人的不确定度占该类相对不确定度的92%、92%、91.2%，故在校正点配制过程因移液、定容等体积因素引人的相对不确定度中可仅考虑V容3-Iml.引人的不确定度8-1药物残留含量的计算值引入的相对不确定度中的22（C测）和u2（f仪器）之和分别占该类相对不确定度的97.6%、95.8%、99.8%，故在22（X计）的计算过程中可仅考虑这两类的不确定度。回收率引人的相对不确定度Nor和Cip分别是Enr的6倍和23倍，这一问题主要是由于Nor和Cip的回收率均值与期望值存在显著性差异，该差异引人的相对不确定占Nor和Cip回收率相对不确定度91.2%、75.3%。3个参数的合成相对标准不确定度排序为Cip>Nor>Enr，且彼此之間差距明显。药物残留含量测定过程中相对不确定度大小主要是由样品中残留药物浓度大小和实际检出含量和真实含量之间的差异决定的，后者无法量化，故引人加标回收来解决这一问题。

（2）由不确定度评定过程可知，不确定度大小与试验流程严格对应，试验流程所涉及的步骤越多则引人的不确定度越多，为确保检测数据的准确性，整个试验流程应尽可能简化。

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