特异性引物GSP对玉米丝黑穗病苗的检测效率

常保增

在对玉米进行某种病原检测中，通常使用的是 PCR 检测技术. PCR 技术用来检测病原物是指选择某一特定的引物去扩增相应的目的 DNA片段. 该实验所采用的引物是由上海生工生物公司合成的玉米丝黑穗病菌的特异性引物（GSP），然后采用 PCR 扩增检测技术可以对玉米病苗中的丝黑穗病菌基因组进行特异性的扩增，对扩增的样品 DNA 进行浓度为1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，最后在凝胶成像系统中进行观察和记录，从而得知玉米是否感染了丝黑穗病. 最后计算出该特异性引物 GSP 对玉米病苗的检测效率，看是否可以用于快速有效的对玉米感病植株在发病之前对病菌进行检测.

1 材料与方法

1. 1 材料准备

（1）丝黑穗冬孢子的观察

称取 10 mg 已经处理好的玉米丝黑穗病菌冬孢子粉，将其置于 1. 5 mL 的离心管中，加入适量的无菌水浸泡过夜，然后置于高速离心机中离心 2 min（10000 r/min），弃掉上清液. 再用无菌水处理 1 d，再次离心并弃掉上清液. 将已经处理好的冬孢子沉淀浸泡于配置好的 2% 葡萄糖溶液中，置于 28 ℃的温箱中黑暗培养3 d，3 d 后观察冬孢子的萌发状态.

（2）试验材料及病菌

玉米感病品种（黄早 4），植物 DNA 提取试剂盒（宝生物公司购买），供试丝黑穗病菌（将事先收集好的病菌样品置于室内晾干，再用筛子充分筛选出孢子粉，将孢子粉置于通风、阴凉、干燥处保存备用）.

（3）配置菌土

土壤采样后放入高压灭菌锅中进行灭菌，待土壤冷却后加入玉米丝黑穗菌粉配置成 1% 的菌土.

（4）播种与接种

选取 200 粒感病品种黄早 4，将种子在 4 月20 日播种于吉林省农业科学院所属的玉米试验田（公主岭），每穴 2 ～3 粒，将配置好的菌土覆盖在玉米种子上.

（5）取样

在玉米抽穗前期（此时病状并未表现出来）对玉米的根与叶片组织进行采样.

1. 2 试验方法

1. 2. 1 DNA 的提取方法（采用试剂盒提取，提取方法参照说明书）

将采集的每份玉米根与叶片的样品取适量置于研钵中用液氮充分的研磨，将研磨好的样品组织（不多于 50 mg）分装于 1. 5 mL 的离心管中，并分别做好标记. 加入400μL LE Buffer，上下颠倒混合均匀，迅速置于 65℃ 环境中温浴 15 ～30 min（期间可震荡离心管 2 - 3 次），然后移出.

1. 2. 2 DNA 纯度的检测

随机抽取已提取的样品 DNA 进行电泳检测，每个随机样品取 5μL 于 1. 5% 的琼脂糖凝胶中进 行 电 泳，电 流 180mA，电 压 180V，电 泳15min，于凝胶成像系统中观察 DNA 的降解情况及是否有 RNA 的影响.

PCR 检测：

（1）所使用的引物购买于上海生工生物公司，引物 GSP 的序列为上游 5’- TCGCCGACGGATGATAATCG -3’下游 5’- GAGTCACCCGCCCAAAGTTA - 3’

（2）反应程序：共设置 35 个循环，步骤如下：94 ℃（预变性）4 min→94℃（变性）1 min→54℃（复性）1 min→72 ℃（延伸）1. 5 min→72 ℃（延伸）5 min→4 ℃环境中保存备用

（3）1. 5%琼脂糖凝胶电泳用万分之一天平称取适量的琼脂糖，加入適量的已配置好的 TAE 溶液配制成 1. 5% 凝胶，用微波炉将其沸腾一次后加入适量的 EB，趁热倒入插好梳子的制胶槽中，待凝胶凝固后加入 PCR的产物，10 μL 的样品，并加入 DNA Marker.

（4）电泳的结果在凝胶成像系统中进行观察和记录.

2、结果与分析

2. 1 玉米丝黑穗冬孢子萌发情况的观察从温箱中取出已培养 3 d 的玉米丝黑穗冬孢子，吸取适量的冬孢子滴于载玻片的中央，并滴几滴无菌水后盖上盖玻片，至于电子显微镜下观察其萌发状态. 结果如下.冬孢子萌发前的状态，在将其至于 2%的葡萄糖溶液中，28℃黑暗培养 3 d 后，其萌发状态. 说明该丝黑穗冬孢子粉具有活性且能正常萌发，可以使用其对玉米进行侵染.

2. 2 DNA 的提取与检测

将采用试剂盒方法提取的 DNA 样品，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，用试剂盒所提取的样本组织的 DNA 可以获得高质量的 DNA，可以用于后续的实验.

2. 3 PCR 结果检测

2. 3. 1 玉米叶片组织中丝黑穗病原菌的检测为带病玉米植株叶片组织 DNA的电泳结果，其中 M 是 DNA Marker，1 ～10，13 ～22 均为黄早 4 未发病叶片组织 DNA，11、23 均为水（CK），12、24 均为玉米丝黑穗病菌的 DNA. 根据图 4 可知，以玉米叶片 DNA 为模板进行病菌PCR 检测发现只扩增出了 3 条与玉米丝黑穗病菌在同一范围内的谱带，其中 5 号较为明显，14号、21 号均不明显，病菌的检测效率仅为 15%.

2. 3. 2 以玉米根组织中丝黑穗病原菌的检测为带病玉米植株根组织 DNA 的电泳结果，其中 M 是 DNA Marker，1 ～10，13 ～22均为黄早 4 未发病根组织 DNA，11、23 为水（对照），12、24 为玉米丝黑穗病菌的 DNA. 以玉米叶片 DNA 为模板进行病菌 PCR 检测发现扩增出了 16 条与玉米丝黑穗病菌在同一范围内的谱带，仅有 2 号、3 号、5 号没有扩增出谱带，13 号不太明显，病菌的检测效率为 80%.

在对玉米丝黑穗病进行 PCR 研究时，通常提取的是玉米下部组织的 DNA 而不采用玉米叶片组织的 DNA. 通过查阅相关的文献发现，玉米丝黑穗病属于幼苗期侵染的一种系统性的病害，丝黑穗的病原菌以散落在土壤中、混入到粪肥中或附着在玉米种子表面的冬孢子越冬，第二年成为主要的传染源，其中以土壤带菌侵染为主.病原菌于种子萌发开始从根茎、胚芽以及芽鞘侵染，并且在植株体内形成菌丝，跟随着植物向上生长. 因此，在玉米植株的下部组织 DNA 中的病原菌浓度要远远大于上部组织 DNA 中的病原菌浓度，而叶片中的病原菌数量要低于茎髓组织和根部组织甚至是没有，因为病原菌菌丝是选择性的对植株的部位进行侵染的，若选择侵染叶片则不利于病原菌的繁殖.

参考文献

[1]  李玥莹，董雪卉，许丽，等. 玉米抗丝黑穗病基因 RAPD 分析[J]. 生物技术，2006（5）：16 -18.

[2]  邢跃先，吴凤新，蔡鑫茹，等. 叶片 DNA 对玉米丝黑穗病研究的可靠性[J]. 玉米科学，2008（6）：114 -116.

[3]  晋齐名. 东北地区玉米、大豆重要病虫害识别与防治. 吉林：吉林科学技术出版社