AM真菌对煤矿沉陷区不同复合基质上紫花苜蓿生长和生理特性的影响
2019-09-10段凝闫明
段凝 闫明
摘 要：該研究采用盆栽试验法，以紫花苜蓿（Medicago sativa）为材料，将煤矸石（CG）、粉煤灰（FA）和沙土（SS）按不同质量配比设置T1（CG∶FA∶SS=75%∶25%∶0%）、T2（CG∶FA∶SS=60%∶25%∶15%）、T3（CG∶FA∶SS=45%∶25%∶30%）、T4（CG∶FA∶SS=30%∶25%∶45%）四组混合基质以模拟，并以T5（CG∶FA∶SS=0%∶0%∶100%）为对照，AM真菌选用摩西斗管囊霉（F.m）和幼套近明球囊霉（C.e），通过单接菌和混合接菌，探索其对紫花苜蓿根系的侵染率、幼苗生长、抗氧化物酶活性和渗透调节物质变化的影响。结果表明：（1）在五组基质上，接种AM真菌显著提高了紫花苜蓿根系的菌根侵染率和菌根依赖性，且基质T4接种F.m+C.e[F.m∶C.e=1∶1（W/W）]的值最大（64.31%和86.24%）。（2）接种AM真菌不同程度提高了紫花苜蓿株高、基径、叶面积和生物量，且混合接菌的效果优于单接菌。（3）基质中填加过量煤矿废弃物抑制了植株根系的生长，接种AM真菌后显著提高了紫花苜蓿总根长、根表面积、根体积，降低了根平均直径。（4）不同接菌处理的紫花苜蓿叶片POD、SOD、CAT活性以及可溶性糖、可溶性蛋白含量总体表现为F.m+C.e>C.e>F.m>non-AMF，且接种F.m+C.e的增长幅度最大。研究表明煤矿废弃物复合逆境抑制紫花苜蓿的生长，接种AM真菌显著提高了幼苗生长、抗氧化物酶活性和渗透调节物质，提高了植物抗逆性能，且以基质T4接种F.m+C.e的效果最佳。
关键词： 丛枝菌根真菌（AMF）， 煤矿废弃物 ， 紫花苜蓿， 生长， 抗氧化系统， 渗透调节物质
中图分类号：Q946
文献标识码：A
文章编号：1000-3142（2019）05-0650-11
Effects of AM fungi on growth and physiologicalcharacteristics of Medicago sativain different compositesubstrates in coal mining subsidence areas
DUAN Ning， YAN Ming*
（ School of Life Sciences， Shanxi Normal University， Linfen 041000， Shanxi， China ）
Abstract：To improve the growth and survival race of plants in coal mine waste， potting experiment in greenhouse was carried out to explore the effects of single and mixed inoculation with AM fungi（ Funneliformis mosseae， F.m and Claroideoglomus etunicatum， C.e） on the mycorrhizal colonization rate， seedling growth， antioxidant enzyme activity and osmotic adjustment substances of Medicago sativa in different compound substrates. The compound substrates were formed by mixing coal gangue（CG）， fly ash（FA） and sandy soil（SS） mixed in different proportions T1（CG∶FA∶SS=75%∶25%∶0%）， T2（CG∶FA∶SS=60%∶25%∶15%）， T3（CG∶FA∶SS=45%∶25%∶30%）， T4（CG∶FA∶SS=30%∶25%∶45%） and T5（CG∶FA∶SS=0%∶0%∶100%） was taken as control. The results were as follows： （1） Inoculation of AM fungi significantly increased the mycorrhizal colonization rate and mycorrhizal dependency of M.sativa’s root in five different compound substrates. However， the maximum mycorrhizal colonization rate and mycorrhizal dependency after inoculation of F.m+C.e [F.m∶C.e=1∶1（W/W）]（64.31% and 86.24%） occurred in T4 substrate. （2） Inoculation with AM fungi increased height， stem diameter， leaf area and biomass of M. sativato some degrees， and the effects of mixed inoculation were better than that of single inoculation. （3） Growth of plant roots were inhibited by excessively adding coal mine solid waste. However， inoculation of AM fungi could significantly promote total length， surface area and volume of root， and decreased root average diameter. （4） Comparative effects of different inoculation treatments on POD activity， SOD activity， CAT activity， soluble sugar content and soluble protein content of M. sativaleaves with were F.m + C.e > C.e > F.m>non-AMF， and the optimal effect was showed in inoculated with F.m +C.e. Our results suggested that growth of M. sativa was realistically inhibited in coal mine waste. However， AM fungi significantly enhanced resistance to stress by improved seedling growth， antioxidant enzyme activity， and osmotic adjustment substances， especially the combination of F.m+C.e and compound substrate T4 was the best.
Key words： arbuscular mycorrhizal fungi（AMF）， coal mine waste， Medicago sativa， growth， antioxidant system， osmotic adjustment substance
煤炭开采造成大规模土地资源破坏，地表塌陷是最主要的表现形式，加剧了矿区地表水土流失、养分损失、植被受损（杨勤学等，2015），使原有的生态环境遭到破坏，加剧了我国日益紧张的人地矛盾。近年来，虽然国内外诸多学者在矿区生态恢复、矿山废弃地土壤质地改良等方面取得了许多进展，但矿区复垦植被成活率低、抗逆性差，人工植被覆盖度仍很低，植被重建的生态效应不明显（毕银丽，2017）。将粉煤灰、煤矸石作为填充基质结合丛枝菌根微生物技术的复垦方式已经受到广泛关注。丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal， AM）真菌作为自然界较为活跃的一类有机体，大约80%的陆生高等植物均能与其形成特定的“菌根”结构（周宝利等，2015）。大量研究表明，低磷条件下，接种AM真菌有助于促进宿主植物对磷、钾等矿质元素的吸收，提高植物的抗逆性，促进植物生长，改善土壤结构（Cheng et al.， 2012）。AM真菌的侵染能够增加宿主植物不定根和侧根的数量，改变植物的根系形态（毕银丽等，2017，2014）。AM真菌分泌的球囊霉素相关土壤蛋白能增加土壤有机碳库，增强土壤团聚体的稳定性，对土壤具有改良效应（贺学礼等，2011）。
目前，关于AM真菌对以黑麦草、拧条为宿主植物的煤矿复垦区土壤结构和质量的改良作用（王丽萍等，2012;孙金华等，2017）、AM真菌对以玉米为宿主植物的煤矿塌陷地受损伤植物根系的修复功能（Guo et al.， 2014）以及AM真菌对小麦矿质营养的吸收作用（马放等，2014）和玉米对重金属的吸收与转移（Radka & Miroslav， 2007）等方面研究众多，而对于以紫花苜蓿（Medicago sativa）作为矿山植被复垦的先锋植物研究较少，以及如何合理填充煤矿废弃物以提高菌根与紫花苜蓿的共生性，改善植物营养生长，根系形态变化，提高植物的抗逆性能等方面鲜有报道。由于紫花苜蓿根系发达、固氮性强、适应范围广，本研究将其作为研究对象，将煤矸石、粉煤灰和沙土按不同质量配比混合作为栽培基质，通过接种AM真菌，研究不同复合基质上接种AM真菌对紫花苜蓿生长以及抗逆性的影响，从而为菌根技术在煤矿沉陷区植被生长发育地运用提供理论与材料的支持，为煤矿废弃地的土地复垦与生态恢复提供一种微生物综合推广应用模式，同时为解决煤矿开采所带来的生态破坏与环境污染问题提供可行性途径。
1 材料与方法
1.1 材料
盆栽试验于2017年7—10月在山西师范大学试验大棚中开展，紫花苜蓿种子购于临汾市小麦研究所。供试菌种包括摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae， F.m）、幼套近明球囊霉（Claroideoglomus etunicatum， C.e），菌种信息见表1，购于北京市农林科学院植物与营养资源研究所。选用高粱对两种菌种进行扩繁，培养基质、菌根真菌孢子、菌丝体和被侵染根段的混合物作为菌剂。
供试基质由煤矸石（CG）、粉煤灰（FA）、沙土（V黃土∶V河沙=3∶1，SS）混合而成，煤矸石取自临汾市煤运公司煤炭转运站，粉煤灰取自临汾市海资热电厂。试验前期将煤矸石过3 mm筛，粉煤灰、黄土、河沙均过1 mm筛，经121 ℃高压蒸汽灭菌锅灭菌2 h，以杀灭土著AM真菌，风干1周后待用。
1.2 试验设计
采用两因素随机区组设计，设置菌根和基质两个因素。接种菌剂设有4个水平：接种F.m、C.e、F.m+C.e [F.m∶C.e=1∶1（W/W）]和non-AMF。供试基质依据CG、FA和SS的理化性质将其按照质量配比不同依次设置为T1（75%∶25%∶0%）、T2（60%∶25%∶15%）、 T3（45%∶25%∶30%）、T4（30%∶25%∶45%），T5（0%∶0%∶100%）作为对照，其基本理化性质见表2，共同组成20个处理组，每个处理组设3个重复，共计60盆。试验选择规格为16 cm（盆口直径）×11 cm（盆底直径）×14 cm（高）的塑料花盆，每盆盛放1.6 kg基质。
播种前，挑选大小均一、颗粒饱满的种子浸泡在10%H2O2中10 min进行表面消毒，再用去离子水冲洗数遍后至于室温下进行催芽处理，待种子露白后播种。接种AM真菌采用层接法，准确称取150 g菌剂均匀的撒施在已混合均匀的基质表层，再在其上面播入已经催芽的种子20粒，表层覆盖一层薄薄的灭菌土，大约1 cm厚，不接菌对照组加入相同量已经过高温灭菌的菌剂。生长期间试验大盆温度范围在15～30 ℃之间，每隔3 d浇水一次，保证基质含水量是田间持水量的50%～70%，培养90 d后进行各项指标的测定。
1.3 测定方法
1.3.1 菌根侵染率和菌根依赖性 采用曲利苯蓝染色法染色（赵斌和何绍江，2002），将紫花苜蓿根系洗净加入10%的KOH，80 ℃水浴30 min后弃去KOH，清水轻轻漂洗根样数次，至水不呈黄色即可。将根系剪成1 cm的小段，放入1%的曲利苯蓝中染色，在显微镜下观察并统计被侵染根段数，计算方法如下（王幼珊等，2012）：
菌根侵染率（%）=
∑（0×根段数+10×根段数+…+90×根段数+100×根段数）全部根段;
菌根依赖性=接种植物干重-未接种植物干重接种植物干重×100%。
1.3.2 生长指标 将紫花苜蓿地上部分和根系自茎基部剪开，放入烘箱105 ℃杀青30 min，再在75 ℃下烘干至恒重，分别称其干重。用直尺测量株高;用精度0.02 mm的游标卡尺测量茎粗;用LI-3000C叶面积仪测定叶片面积;用Delta-TSCAN根系分析系统测量总根系长、根系表面积、根体积，根平均直径。
1.3.3 叶片生理指标 测超氧化物歧化酶（SOD）活性用NBT法， 过氧化物酶（POD）活性用愈创木酚法，过氧化氢酶（CAT）活性用紫外吸收法（高俊凤，2006），可溶性糖含量用蒽酮比色法，可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝G-250染色法（张志良等，2009）。
1.4 数据处理
采用SPSS 17对数据进行统计分析，测定结果表示为平均值±标准误，Duncans 法检验显著性水平P<0.05各处理平均值间的差异显著性，并采用双因子方差分析基质和菌剂的作用以及二者的交互作用，用Origin 8.5绘制柱状图。
2 结果与分析
2.1 接种AM真菌对紫花苜蓿根系菌根侵染率和菌根依赖性的影响
表3显示，在五组基质中，non-AMF处理的紫花苜蓿根系菌根侵染率和菌根依赖性为0，说明对照组未被AM真菌侵染。相同基质中不同接菌处理的紫花苜蓿根系的菌根侵染之间具有显著性差异（P<0.05）。基质T1上接种AM真菌紫花苜蓿菌根侵染率最小，基质T4上接种AM真菌根系的侵染效果最佳，且接种F.m+C.e的菌根侵染率最大，为64.31%。菌根依赖性的大小趋势与侵染率保持一致，基质T4上接种F.m+C.e紫花苜蓿根系的菌根依赖性最大，为86.24%，与接种C.e和F.m相比具有显著性差异（P<0.05）。双因子结果分析表明，基质和菌剂对紫花苜蓿根系的菌根侵染率和菌根依赖性具有极显著差异（P<0.001）基质类型和接菌处理二者的交互作用对紫花苜蓿根系的菌根侵染率影响非常显著（P<0.01），对菌根依赖性影响显著（P<0.05）。
2.2 接种AM真菌对紫花苜蓿地上部生长的影响
表4显示，各组基质中接种AM真菌的紫花苜蓿株高与non-AMF相比具有显著性差异（P<0.05），表现为F.m+C.e>C.e>F.m>non-AMF。接种F.m+C.e，基质T4与T5的株高差异不显著，基质T4上接种F.m+C.e株高值最大与non-AMF相比增加了83.37%。基质T1接种F.m的株高最小与non-AMF相比增加了34.02%。各组基质接种AM真菌植株基径大小与non-AMF相比差异显著（P<0.05），但各接菌处理间没有显著性差异。五组基质的基径大小比为T4>T5>T3>T2>T1。基质T4接种F.m+C.e的基径最大比non-AMF高58.61%，基质T1接种F.m的基径增幅最小。植株的叶面积总体趋势与株高和基径一致，基质T4接种F.m+C.e植株的叶面积最大较non-AMF增长了89.96%。基质T1接种F.m+C.e的叶面积与non-AMF具有显著性差异（P<0.05），接种C.e、F.m与non-AMF没有显著性差异。混合接菌基质的紫花苜蓿地上部干重增长幅度大于单接菌，基质T4接菌F.m+C.e的地上部干重最大，与non-AMF比较增加了215.38%。基质T1接种AM真菌地上部干重增长幅度最小。双因子分析结果表明，基质和接菌处理对紫花苜蓿的株高、地上部干重具有极显著影响（P<0.001），对基径和叶面积具有非常显著影响（P<0.01），二者交互作用对紫花苜蓿株高具有极显著影响（P<0.001）， 对基径、叶面积和地上部干重无显著性影响。
2.3 接种AM真菌对紫花苜蓿根系生长的影响
表5显示，接种AM真菌对不同基质的紫花苜蓿根系总长、根表面积、根体积和根系干重均具有显著性差异（P<0.05），总体趋势表现为T4>T5>T3>T2>T1。不同接菌处理间根系总长和根表面积具有显著性差异（P<0.05）。基质T4上接菌的效果最佳，接种F.m+C.e较non-AMF增幅最大，根系总长增加了122.72%，根表面积增加了131%。基质T1上接菌对根系生长的促进作用较小，接种F.m较non-AMF增幅最小，根系总长增加了30.08%，根表面积增加了25.65%。 对于根体积，尽管部分基质上不同接菌处理间没有显著差异，但均表现出增长趋势。基质T4上接种F.m+C.e根体积比non-AMF增加132.33%。基质T1上AM真菌对根体积的促进作用最小。对于根平均直径，接种AM真菌五组基质表现为T1>T2>T3>T4>T5，基质T5上接种F.m+C.e的根平均直径最小，但基质T4接种F.m+C.e根平均直径降低幅度最大，与non-AMF相比降低了57.78%。基质T4接种F.m+C.e的根系干重最大，与non-AMF相比增加了204%。基质T1接菌AM真菌根系干重增幅最小，接菌F.m+C.e和C.e没有显著性差异。双因子分析结果表明，基质和接菌处理对紫花苜蓿的根系总长、根表面积、根体积、根平均直径以及根干重具有极显著影响（P<0.001），二者交互作用對紫花苜蓿根系总长、根体积具有极显著影响（P<0.001），对根表面积、根平均直径、根干重有非常显著影响（P<0.01）。
2.4 接种AM真菌对紫花苜蓿叶片生理指标的影响
2.4.1 接种AM真菌对紫花苜蓿叶片POD、SOD、CAT活性的影响 图1显示，与non-AMF相比，接种AM真菌对紫花苜蓿叶片的抗氧化物酶活性提高具有显著促进作用。同一基质不同接菌处理的紫花苜蓿叶片POD、SOD、CAT活性大小趋势为F.m 2.4.2 接种AM真菌对紫花苜蓿叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响 图2显示，接种AM真菌在五组基质，叶片的可溶性糖和可溶性蛋白含量总体表现为T1 3 讨论与结论 侵染率是反应宿主植物与AM真菌之间共生关系的重要指标，菌根侵染率越高，表明其与宿主植物的共生性越好，对促进植物生长，提高植物抗逆性的可能越大（李建华等，2009）。本研究结果表明，不同复合基质中AM真菌均能与紫花苜蓿建立良好的共生关系，适量减少煤矸石填加量有助于提高植物的菌根侵染率和菌根依赖性，这可能由于煤矸石的重金属含量高、物理结构差、微生物活性低（魏怀建等，2015），过量填加会对植物根系造成损伤，且水分和养分的保蓄能力差，不能为宿主植物和菌根的共生提供相对稳定的环境。五组基质相比，T4基质更有利于AM真菌对紫花苜蓿根系的侵染，这可能与基质的酸碱性、有机质和矿物质含量、水分的储存等综合作用有关。比较3种接菌处理，F.m+C.e的效果最佳。任禛等（2015）研究表明，虽然不同菌剂间存在着对生态位点和光合产物的竞争性，但不同菌剂之间的协同效应要强于其竞争性，因而混合菌剂表现出了高的侵染率。毕银丽等（2005）研究发现，菌根与基质间具有一定的选择性，不同的基质对AM真菌的生态适应性不同，与宿主植物的共生性不同，因而对宿主植物的菌根侵染率和菌根依赖性大小不同。 不同基质接种AM真菌均能够增加植株的高度、基径、叶面积和生物量，煤矸石填加量越大AM真菌对宿主植物生长的促进作用越弱，适量填加煤矸石的基质AM真菌对植物生长的促进作用大于纯沙土基质。这可能是由于填加过量煤矸石抑制了AM真菌对根系的侵染，从而抑制了植物的生长，而合理填加煤矸石、粉煤灰丰富了基质中的矿质元素和有机质，并通过菌根作用促进植物吸收。于淼等（2013）研究表明，在一定的阈值内接种AM真菌能够提高宿主植物对微量矿质元素的吸收，同时抑制有害金属元素的吸收。Hallett et al.（2009）研究证明，菌根侵染率的大小决定着菌根对宿主植物生长促进作用的大小。另有研究（Enkhtuya et al.， 2005）显示，较低的菌根侵染率能够 促进植物生长，而较高的侵染率对植物生长的促进作用不显著，这也说明侵染率大小并不能完全反应菌根对植物生长的作用。 根系是植物吸收水分、养分以及合成多种氨基酸的重要器官。本研究發现，不接种AM真菌紫花苜蓿根系也能较好生长，这可能与其自身较强的耐受力有关。接种AM真菌显著提高了紫花苜蓿的根系总长、根表面积、根体积，AM真菌通过菌丝分泌物影响宿主植物根系的分泌物组成和数量，改变植物根际环境（祖艳群等，2015）从而促进宿主植物根系生长，这与张中峰等（2015）研究结果保持一致。复合基质的配比不同AM真菌对宿主植物根系生长的促进作用不同，基质T4总根长、根表面积、根体积最大，这可能是由于T4的土壤理化性质相对适宜、储水性好、通透性强，提高了菌根与宿主植物的联合作用，促进了根系的生长。接种AM真菌显著减小了根系平均直径，这与高雁琳等（2016）研究结果一致。基质T5的根系平均直径小于基质T4，这可能由于T5基质与T4相比，土壤贫瘠、质地均一、粒径小、吸水性强，根系需穿透土壤中有机物的颗粒间隙吸收养分和水分供应植物的生长。同一基质3种接菌处理紫花苜蓿总根长、根表面积、根体积大小为F.m+C.e>C.e>F.m，根系平均直径的大小为F.m+C.e 抗氧化物酶是反应植物代谢和抗逆性的指标，对细胞膜具有保护作用。自然状态下，植物体的抗氧化物酶活性维持在较稳定的水平，当植物体受到逆境胁迫时，细胞的活性氧含量就会升高，抵御过量的氧自由基对细胞造成的伤害，维持生理平衡（王定景等，2012）。本研究结果表明，无论是否进行接菌处理，五组基质的叶片POD、SOD、CAT活性大小趋势为T1 逆境胁迫促使植物细胞积累一些渗透调节物质来维持细胞膨压对某些生理功能的调控，缓解其对植物造成的伤害（康云艳等，2011），可溶性糖和可溶性蛋白是重要的渗透调节物质。本研究结果表明，接种AM真菌能够提高叶片可溶性糖和可溶性蛋白的含量，且适量填加煤矿固体废弃物的基质接种AM真菌有助于叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量的增加，可见一定的胁迫有助于提高AM真菌对植物的抗逆性能。赵霞等（2017）研究证明，具有一定盐碱胁迫的基质接种AM真菌对紫花苜蓿渗透调节物质积累的作用大于正常基质。前人在番茄（Wang et al.， 2011）、羊草（刘滨硕等，2014）等的研究中也得到类似结果。此外，混合接菌更有助于紫花苜蓿体内渗透调节物质的积累，维持细胞正常代谢，降低复合基质这一特殊的立地环境对细胞造成的伤害，这与赵琦等（2015）研究结果一致。 综上所述，AM真菌对以煤矿废弃物为填充基质的采煤沉陷地的植被重建具有潜在的应用价值，紫花苜蓿作为先锋物种有助于提高复垦植被成活率，提高植被覆盖度，增强植被重建的持续效果。但室内模拟与野外实地试验存在一定的差异，接下来应结合相应的工程措施具体应用于野外实地，探讨“基质-紫花苜蓿-菌种”组合在煤矿沉陷区生态恢复的实际作用效果。 參考文献： BI YL，2017. 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