橡胶树茉莉酸信号途径相关基因表达与橡胶产量的相关性

杨署光　赵悦　陈月异　李言　张世鑫　田维敏

摘 要：割胶促进橡胶树合成天然橡胶与激活乳管细胞的茉莉酸信号途径密切相关，但茉莉酸信号途径关键环节的基因表达水平与干胶产量的相关性尚不清楚。为了找到与产量相关的分子标记，该研究采用qPCR技术，分析了割胶条件下茉莉酸信号途径关键环节的9个相关基因在5个橡胶树魏克汉种质和5个1981’IRRDB种质乳管细胞中的表达。结果表明：大多魏克汉种质的株次干胶产量显著高于1981’IRRDB种质。在9个基因中，除了HbMYC4和HbMYC5，其余7个基因在大多橡胶树魏克汉种质中的表达量均显著高于1981’IRRDB种质，尤其是HbMYC3基因表达差异性好，与干胶产量相关性高，有望作为橡胶树产量育种的一个分子标记。这对育种周期长的橡胶树产量育种具有实际应用价值。

关键词： 巴西橡胶树， 割胶， 橡胶生物合成， 茉莉酸信号途径， HbCOI1， HbJAZs， HbMYCs， 基因表达

中图分类号：Q943.2

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2019）05-0641-09

Correlation between expression level of genes relatedto jasmonate signalling and rubber yield

YANG Shuguang1， ZHAO Yue2， CHEN Yueyi1， LI Yan1， ZHANG Shixin1， TIAN Weimin1*

（ 1. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Key Laboratory of Rubber Biology and Genetic Resources of RubberTree， Minstry of Agriculture and Rural Affoirs， P. R. China/State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops，Danzhou 571737， Hainan， China; 2.College of Agronomy and Biotechnology， China Agricultural University， Beijing 10093， China ）

Abstract：Tapping-enhanced rubber biosynthesis is closely related to the activation of jasmonate signaling in laticifer cells of rubber tree. The relationship between the expression level of the genes involved in jasmonate signaling and dry rubber yield remains not elucidated. In the present study， the expression of nine genes related to jasmonate signaling was analyzed by qPCR in the laticifer cells of five Wichham germplasms and 5 1981’IRRDB germplasms upon tapping with S/2 d/3 tapping system. The rubber yield per tapping of most Wichham germplasms was significantly higher than that of 1981’IRRDB germplasms. Except for HbMYC4and HbMYC5， the expression level of the other seven genes in most of Wichham germplasms was significantly higher than that of 1981’IRRDB germplasms. It was noted that the expression of HbMYC3was highly different and closely related to the rubber yield， which may be used as a candidate marker for rubber yield-breeding of rubber tree.

Key words： Hevea brasiliensis， tapping， rubber biosynthesis， jasmonate signaling， HbCOI1， HbJAZs， HbMYCs， gene expression

茉莉酸是植物應对逆境胁迫的关键信号分子（Qi et al.， 2011），其信号传导的三个核心环节是COI1、JAZ和MYC（Chini et al.， 2009）。在缺乏JA-Ile（活性形式JA）（Fonseca et al.，2009）时，JAZ蛋白与MYC2互作，抑制MYC2对JA响应基因的转录激活。例如，在拟南芥中，AtJAZ1和AtJAZ3蛋白通过抑制AtMYC2、AtMYC3和AtMYC4转录因子，影响硫代葡萄糖苷（glucosinolate）的合成（Schweizer et al.，2013）。AtJAZ1和AtJAZ3蛋白与WD-Repeat/bHLH/MYB复合体相互作用，抑制花青素的合成（Qi et al.，2011）。但是，在JA-Ile存在的条件下，JAZ与COI1结合，进而通过26S蛋白酶体被降解，使MYC2转录激活JA响应基因（Donnell et al.，1996;Chini et al.，2007;Qi et al.，2011）。发生在橡胶树乳管细胞中的橡胶生物合成是一种典型的植物类异戊二烯代谢。最近研究表明，割胶树的乳管细胞茉莉酸含量显著高于未开割树，割胶促进天然橡胶生物合成与激活乳管细胞中的茉莉酸信号途径密切相关（Deng et al.，2018）。但是，茉莉酸信号途径关键环节的相关基因表达与橡胶产量的相关性尚不清楚。本研究通过分析茉莉酸信号途径关键环节相关基因的表达与橡胶产量的相关性，旨在找到与产量相关的分子标记，对于育种周期长的橡胶树产量育种具有重要的实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

所用材料为割龄10 a的巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）的5份魏克汉种质和5份1981’IRRDB种质。其中，5份魏克汉种质是经过人工选育的橡胶树品种PR107、RRIM600、热垦628、热垦525和热垦523;5份1981’IRRDB种质是未经人工选育的，种质编号为RO/CM/10 44/160、MT/IT/13 29/8、RO/C/8 24/104、RO/I/103 107、RO/CM/10 44/454。均种植于中国热带农业科学院实验场。DNaseⅠ购自天根公司;反转录试剂盒RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit购自Ferments公司;qPCR试剂SYBR Ppermix Ex TaqTMⅡ（2×）（Tli RNaseH Plus）购自大连宝生物公司（TaKaRa Japan）;其他生化试剂均为进口或国产分析纯试剂。引物合成由Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 材料处理 每个种质选3株，在生产中正常割胶（S/2D d3：二分之一树围，阳刀，每三天割一刀）的第10刀，收集前10 min流出的胶乳，每个种质均取3株的等体积混合样，用于提取胶乳总RNA。

1.2.2 干胶产量测定方法 该研究中的干胶产量测定参照曾霞等（2006）的方法进行。

1.2.3 总RNA的提取与cDNA的合成 胶乳总RNA提取参照曾日中等（2003）的方法。cDNA第一链的合成根据试剂盒的操作步骤进行：取1 μg胶乳总RNA反转录合成cDNA第一链，稀释10倍后作为qPCR分析的模板。

1.2.4 基因表达分析

1.2.4.1 qPCR反应 qPCR反应体系为20 μL，其中SYBR Ppermix Ex TaqTMⅡ（2×）10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL（引物浓度为10 μmol·L<SUP>-1</SUP>，每条引物终浓度均为0.2 μmol·L<SUP>-1</SUP>）、cDNA模板1 μL、ddH2O 8.2 μL。qPCR反应在LightCyclerCapillaries（20 μl，Roche）毛细管中完成，在Roche Diagnostics公司的LightCycler Real Time PCR扩增仪中运行，操作按仪器使用说明书进行。qPCR反应程序：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，共40个循环，40个循环后进行溶解曲線分析（60～95 ℃，0.2 ℃·S-1），运行结束后冷却至40 ℃。每个样品做2次技术性重复，Cq标准差控制在0.2以内。利用LightCycler Software 4.05软件采集qPCR反应的Cq值。

1.2.4.2 qPCR引物筛选 根据GenBank登录的基因的cDNA全长序列设计qPCR引物。以10倍梯度稀释的cDNA为摸板制备标准曲线，获得目的基因qPCR引物的扩增效率，选择扩增效率在85%以上的引物对开展实验;通过溶解曲线峰的数目判断引物的特异性，选择具有单一的溶解曲线峰的引物对开展实验;获得的qPCR产物通过测序印证。本研究所用引物见表1。

1.2.4.3 基因表达分析 根据“Q=2△Cq=2min Cq-Sample Cq”计算基因的表达值（Q），以Hb18S作为内参基因，根据“E=Q目的基因/Q内参基因”分析目的基因的相对表达值（E）。样本间相对基因表达倍数（Bénédicte et al.，2002;Silvia et al.，2012;Yuki et al.，2015）可直观的反映出彼此间表达差异的大小，根据“F=EA÷EB”分析样本A对样本B的基因相对表达倍数（folds，F）。

1.3 数据处理

用Excel 2003作图，用SPSS软件的Duncan检验进行多重比较分析：标有不同大写字母表示组间差异极显著（P<0.01），标有不同小写字母表示组间差异显著（P<0.05），而标有相同小写字母表示组间差异不显著（P>0.05）。用Excel TTEST（Array 1，Array 2，Tails 1，Type 1）进行成对比较分析：P<0.01表示组间差异极显著，P<0.05表示组间差异显著。用SPSS软件分析基因表达和干胶产量的Pearson相关性，P<0.01表示极显著相关，P<0.05表示显著相关。

2 结果与分析

2.1 橡胶树种质间株次干胶产量比较

橡胶树不同种质间的株次干胶产量存在明显差异（图1）。热垦523最高，RO/C/8 24/104最低。总体上，大多魏克汉种质的株次干胶产量显著高于1981’IRRDB种质;RO/I/103/107在1981’IRRDB种质中最高，但仅达到在魏克汉种质中最低的PR107的水平，且显著低于其他魏克汉种质;其余4份1981’IRRDB种质的株次干胶产量均极显著低于魏克汉种质，且四者差异不显著。

魏克汉种质与1981’IRRDB种质间株次干胶产量的倍数变化（表2）表明，魏克汉种质的株次干胶产量是1981’IRRDB种质的0.81～17.39倍，平均是6.81倍，不同种质间的表达倍数有明显差异，变异系数为63.66%。

2.2 基因表达分析

2.2.1 qPCR引物筛选 以10倍梯度稀释的cDNA为摸板制备标准曲线，获得目的基因qPCR引物的扩增效率在87%～100%之间（图2：A）;溶解曲线分析表明，各个基因的引物均获得单一的溶解曲线峰，表明获得特异性的扩增产物，无模板对照（NTC）无扩增产物表明反应体系无污染（图2：B）。

2.2.2 橡胶树种质间茉莉酸信号途径关键环节基因的表达分析

qPCR分析表明，HbCOI1（图3：A）和HbMYC2（3：F）仅在1个（20%）1981’IRRDB种质中达到魏克汉种质的表达水平;HbJAZ2（图3：C）和HbJAZ3（图3：D）仅在1（20%）个魏克汉种质中低至1981’IRRDB种质的表达水平;HbJAZ1（图3：B）有2个（40%）魏克汉种质低至1981’IRRDB种质的表达水平;HbMYC4（图3：H）和HbMYC5（图3：I）在魏克汉种质和1981’IRRDB种质中表达水平相当的占80%;值得注意的是，HbMYC1（图3：E）和HbMYC3（图3：G）在所有魏克汉种质中的表达量均显著高于1981’IRRDB种质。统计分析表明，HbMYC1和HbMYC3在魏克汉种质组的表达量极显著高于1981’IRRDB种质组，HbCOI1、HbJAZ1、HbJAZ2、HbJAZ3和HbMYC2的表达量显著高于1981’IRRDB种质组，但HbMYC4和HbMYC5在两组间的表达差异不显著（图3：J）。

魏克汉种质分别对1981’IRRDB种质的基因表达倍数的结果表明（表2），优势表达基因是HbJAZ2、HbJAZ3、HbMYC1和HbMYC3，表达倍数分别为5.30、8.96、5.09和27.79倍。但是，同一基因在不同种质间的表达倍数有明显差异，变异系数分别为47.66%（HbCOI1）、63.01%（HbJAZ1）、72.60%（HbJAZ2）、76.41%（HbJAZ3）、32.83%（HbMYC1）、48.45%（HbMYC2）、45.77%（HbMYC3）、81.17%（HbMYC4）、58.16%（HbMYC5）。值得注意的是，除了Re ken 628 对 RO/I/103 107的表达倍数为8.74倍（0.04%），HbMYC3在5个魏克汉种质对1981’IRRDB种质的表达倍数均在10倍以上（96%）。

统计分析表明，HbCOI1、HbJAZ1、HbJAZ2、HbJAZ3、HbMYC1、HbMYC2和HbMYC3这7个基因在魏克汉种质中的表达平均值均显著高于1981’IRRDB种质，其中80%达到极显著水平（图4）。Pearson相关性分析（表3）表明，HbCOI1、HbJAZ1、HbJAZ3、HbMYC1、HbMYC2和HbMYC3基因表达与干胶产量的相关性均达到0.05的显著水平;其中，HbCOI1、HbJAZ1、HbMYC2、HbMYC3达到0.01的显著水平， 值得注意的是 HbMYC2基因表达与干胶产量的相关性最高。

3 讨论与结论

割胶促进橡胶树合成天然橡胶，2次割胶之间的橡胶再生涉及到橡胶合成酶基因的诱导表达调控（Deng et al.， 2018; 赵悦， 2011）。割胶促进天然橡胶生物合成与激活乳管细胞中的茉莉酸信號途径密切相关（Deng et al.，2018）。茉莉酸信号传导的核心环节是COI1、JAZ和MYC（Chini et al.，2009）;HbMYC1和HbMYC3的基因表达水平与橡胶树种质的干胶产量正相关（卢世香，2010;何鑫，2013）。因此，可通过研究橡胶树“HbCOI1-HbJAZs-HbMYCs”在不同干胶产量种质中的表达差异来筛选产量相关的分子标记。

变异幅度大于2倍的基因为差异表达基因（Bénédicte et al.，2002），高产组种质胶乳中HbCOI1、HbJAZ1、HbJAZ2、HbJAZ3、HbMYC1、HbMYC2和HbMYC3基因的表达水平是低产组种质的2倍以上，表明这7个基因的表达水平与干胶产量正相关。其中HbMYC3基因的表达差异最大，与橡胶树种质的干胶产量相关性最高，有望作为橡胶树产量育种的一个的分子标记。下一步将扩大研究群体来印证该推测。

5个HbMYC家族成员中，HbMYC1、HbMYC2、HbMYC3在胶乳中特异表达，而HbMYC4和HbMYC5主要在花中表达（赵悦，2011）。HbMYC4和HbMYC5的基因表达水平与橡胶树种质的干胶产量不相关，推测参与橡胶合成调控的HbMYCs成员主要是HbMYC1、HbMYC2和HbMYC3。个别的，RO/C/8 24/104中HbMYC5的基因表达水平均极显著高于其他种质，是其他种质的4.34～9.67倍，平均是6.96倍，变异系数仅为29.15%;HbMYC5在橡胶树中的功能尚不完全清楚，RO/C/8 24/104有望成为研究HbMYC5功能的优良材料。

“HbCOI1-HbJAZs-HbMYCs”彼此间以及家族成员间的相互作用（赵悦，2011;刘伟，2011;何鑫， 2013;包杰，2014;肖华，2015;王靖等，2016;姚笛，2016）表明他们在调控橡胶生物合成过程中具有协同作用。尽管个别基因在个别低产种质中已达到高产种质的表达水平，但高产种质中与干胶产量相关的7个基因的整体平均表达水平均显著并且80%极显著高于低产种质，进一步证实了他们之间的协同作用。

韧皮部中次生乳管的分化能力（卢世香， 2010; Chen et al.， 2016）、两次割胶之间橡胶的再生能力（Deng et al.， 2018）和排胶能力（王冬冬等， 2016; 蔡甫格， 2011; 李言等， 2015）是影响橡胶产量的3个主要因素。该研究在橡胶再生能力调控层面获得了一些有价值的结果。非刺激割胶条件下PR107的排胶时间短以及乙烯利刺激能显著延长其排胶时间（王冬冬等， 2016; 蔡甫格， 2011）和增加排胶量（李言等， 2015），说明其具有一定的乳管分化能力，并且排胶能力可能是限制PR107橡胶产量的主要原因之一;PR107中与干胶产量相关的7个基因均具有较高的表达水平说明其橡胶再生能力强，而其干胶产量（非刺激）相对偏低进一步证实该推测。RO/I/103/107的干胶产量在低产种质中最高，已达到PR107的水平;而与干胶产量相关的7个基因中有6个的表达水平均比较低，仅HbMYC2的表达水平与PR107相当;推测其橡胶再生能力弱，但具有一定的乳管分化能力和/或排胶能力，同时也说明单个基因对橡胶产量的贡献不大，也证实了这些基因在调控橡胶再生中的协同（增效）作用。深入研究这3个因素对不同橡胶树种质干胶产量的贡献率，是一个有意义的课题。

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