夏枯草抗乳腺癌成分-靶点-通路的网络药理学研究

李亚梅 彭壮 徐佳 张智敏 林丽美 夏伯候 廖端芳

〔摘要〕 目的 应用网络药理学方法预测夏枯草抗乳腺癌的作用靶点及相关信号通路，挖掘其抗乳腺癌的作用机制。方法 在TCMSP和TCMID数据库中检索并筛选出夏枯草的潜在活性成分，在TCMSP数据库中查询活性成分作用靶点并采用Cytoscape 3.7.1软件构建活性成分-靶点网络图;在HPO和DisGeNET数据库中检索乳腺癌相关基因;将活性成分作用靶点和乳腺癌相关基因进行比对，得到重复项（即活性抗乳腺癌的可能靶点）;利用String平台构建潜蛋白互作网络（PPI）;使用Cytoscape 3.7.1软件构建夏枯草潜在活性成分-靶点-乳腺癌网络，并根据度值、介数和紧密度筛选出关键靶点;应用Metascape数据库分析关键靶点的KEGG信号通路并进行GO生物过程富集。结果 夏枯草中有19种活性成分，作用于253个靶点;夏枯草有17种成分可作用于乳腺癌相关的29个靶点，其中有7个关键靶点，7种主要活性成分，9条相关信号通路。结论 夏枯草可通过雌激素受体、细胞特异性周期蛋白、表皮生长因子受体等靶点及相关通路，发挥抗乳腺癌作用。

〔关键词〕 夏枯草;乳腺癌;网络药理学;活性成分

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.08.021

〔Abstract〕 Objective To predict the anti-breast cancer target and related signaling pathways， and explore the anti-breast cancer mechanism of Prunella Vulgaris L. by network pharmacology. Methods The potential active ingredients of Prunella vulgaris L. were searched and screened in the TCMSP and TCMID databases. The targets of potential active ingredients were searched in the TCMSP database， and Cytoscape 3.7.1 software was used to construct active ingredients-target network map. The breast cancer related genes were searched in the HPO and DisGe NET databases. Comparing the target of active ingredients of breast cancer-related genes to get duplicates （i.e. possible targets of active anti-breast cancer）. The potential protein interaction network （PPI） was constructed by using the String platform. The cytoscape 3.7.1 software was used to construct a potential active component-target-breast cancer network of Prunella vulgaris L.， and screen out the key targets based on the median of degree， betweenness and closeness. Metascape database was applied to analyze KEGG signaling pathways of key targets and perform GO biological processes enrichment. Results There were 19 active components in Prunella vulgaris L.， which acted on 253 targets， and it had 17 components that acted on 29 targets associated with breast cancer， 7 key targets， 7 main active ingredients， and 9 related signaling pathways. Conclusion Prunella vulgaris L. can play the anti-breast effect through estrogen receptor， G1/S-specific cyclin-D1， epidermal growth factor receptor and some correlation signaling pathway.

〔Keywords〕 Prunella vulgaris L; breast cancer; network pharmacology; active ingredients

夏枯草，唇形科夏枯草屬植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥成熟果穗[1]，始载于《神农本草经》，味苦、辛，性寒，具有清肝泻火、明目、散结消肿之功，用于目赤肿痛、目珠夜痛、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈、乳癖和乳房胀痛等;《本草从新》有夏枯草“治瘰疬、鼠瘘、瘿瘤、癥坚、乳痈、乳岩”的记载;《本草经疏》载“治乳痈，乳岩。”可见古人已对夏枯草用于治疗乳腺疾病有较深的研究。

近年来，夏枯草化学成分、药理机制及临床应用的研究很多[2-3]，目前已从夏枯草植物中分离得到约200个化合物，其中大部分为三萜、甾醇和黄酮类化合物，其次为香豆素、苯丙醇、多糖和挥发油[4];夏枯草具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌、抗病毒、抗甲状腺肿、护肝等广泛的药理作用[5-9];在临床上，夏枯草用于乳腺增生、高血压等[10]。但整体系统地分析其成分、靶点、通路和疾病的相互关系未见报道。网络药理学[11]、整合药理学[12]等概念的相继提出，以及生物信息学、分子生物学、计算机技术的不断发展和联合应用，为中医药现代化提供了新的研究思路与方法[13-14]，采用整合生物信息学、分子生物学及各大相关数据库信息，系统地研究“药物-靶点-通路-疾病”之间相互作用，探究中医药“多成分、多靶点、多途径”药理机制，与中医药的整体观、辨证论治、组方配伍、协同增效等原则不谋而合[15]。本研究利用网络药理学方法，探索夏枯草的主要物质基础、核心靶点及与疾病之间的相互关系，为进一步阐明夏枯草抗乳腺癌作用机制提供思路和理论基础。

1 材料与方法

1.1  所需数据库和软件

TCMSP数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）;TCMID数据库（http：//119.3.41.228/tcmid/search/）;STITCH数据库（http：//stitch.embl.de/）;STRING数据库（https：//string-db.org/）;Cytoscape 3.7.1软件;Pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）;HPO数据库（https：//hpo.jax.org/app/）;DisGeNET数据库（http：//www.disgenet.org/）;Drugbank数据库（https：//www.drugbank.ca/）;TTD数据库（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）;UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）;Metascape数据库（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）;KEGG数据库（https：//www.genome.jp/kegg/）。

1.2  方法

1.2.1  夏枯草活性成分检索与筛选  在TCMSP数据库（中药系统药理学分析平台，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）查询夏枯草成分，依据药物ADME（吸收、分布、代谢及排泄）特性，且参照多篇文献标准，将数据库中的口服利用度（OBioavail， OB）和类药性（drug-likeness， DL）作为筛选的关键参数[16]，夏枯草化学成分中满足OB>30%且DL>0.18的化合物作为活性成分。此外，药物口服利用度低的可做成其他剂型，因此，通过TCMID数据库和文献检索，补充夏枯草中的其他有效成分。将筛选出的夏枯草有效成分在Pubchem数据库中查询其结构式，并采用SMILES表达式。

1.2.2  夏枯草活性成分靶点挖掘  通过TCMSP靶点查询夏枯草活性成分的作用靶点，并通过Uniprot数据库将查询到的靶点蛋白名转换为基因名。采用Cytoscape 3.7.1对夏枯草活性成分和作用靶点进行相关网络构建。

1.2.3  疾病相关基因检索  在HPO数据库和DisGeNET数据库中检索乳腺癌（breast cancer）的靶基因，去除重复项，并查阅乳腺癌靶基因的相关文献[17]，汇总乳腺癌靶基因。并在UniProt数据库中进行基因和蛋白的转换。

1.2.4  蛋白互作网络构建  将“1.2.2”和“1.2.3”项得到的靶点进行比对，找出重复的靶点，将这些重复靶点导入到STRING数据库，选择物种为“Homo sapiens”（智人）进行操作，最低相互作用閥值设为中等“medium confidence=0.4”，构建靶点群蛋白互作网络（protein protein interaction network， PPI network）[18]，即“夏枯草-靶点-乳腺癌”网络。

1.2.5  关键靶点的筛选  应用Cytoscape 软件的对PPI 网络进行拓扑属性分析，计算网络整体的“节点度值分布（Node Degree Distribution）、介数中心性（Betweenness Centrality）”，以Degree、Betweenness和Closeness的均数为“阈值”，选取Degree、Betweenness和Closeness同时在阈值之上的靶点为“关键靶点”，研究关键靶点可能的药理作用。

Degree反映了网络节点与其他节点的连接数目;Betweenness是网络中所有最短路径中经过该节点的路径数目与最短路径总数之比;Closeness是通过节点间的传递距离来对节点的重要度进行衡量。Degree、Betweenness和Closeness是衡量一个节点在网络中重要性的主要拓扑参数，也是判断一个靶蛋白是否为“关键靶点”的重要依据[19]。

1.2.6  关键靶点的代谢通路与生物过程分析  为进一步研究夏枯草抗乳腺癌的作用情况，采用Metascape平台对夏枯草的抗乳腺癌靶点群进行KEGG代谢通路富集分析，研究夏枯草靶点的主要抗乳腺癌代谢通路;再进行GO生物过程富集分析，诠释夏枯草靶点的抗乳腺癌生物过程，Metascape平台列表与背景均设置“Homo Sapiens”（人类）进行操作。

2 结果

2.1  夏枯草活性成分

如表1所示，在TCMSP数据库中共挖掘到夏枯草活性成分11个，通过TCMID数据库和文献检索得到8个活性成分。

2.2  夏枯草活性成分靶点

通过TCMSP数据库查询夏枯草活性成分靶点得到，19种夏枯草活性成分的靶點数分别为：M1， 37个;M2，63个;M3，3个;M4，31个;M5，8个;M6，57个;M7，2个;M8，2个;M9，2个;M10，17个;M11，149个;M12，1个;M13，55个;M14，33个;M15，9个;M16，6个;M17，21个;M18，6个;M19，45个。

去除重复项和非人种属靶点，19种活性成分共作用于253个靶点。

如图1 所示，通过Cytoscape 3.7.1软件得到夏枯草活性成分-作用靶点的网络图，19个菱形表示夏枯草的活性成分（M1-M19代表的化合物见表1），253个不规则四边形为活性成分作用靶点，共有540条边代表靶点和化学成分之间的相互作用，体现了夏枯草多成分、多靶点的特点。

2.3  乳腺癌相关基因

在HPO数据库和DisGeNET数据库中检索乳腺癌（breast cancer）的靶基因，共得到256个基因，其中HPO中检索到23个基因，DisGeNET中检索到253个，有20个重复。

2.4  蛋白互作网络构建图

在HPO数据库和DisGeNET数据库中检索乳腺癌（breast cancer）的靶基因与夏枯草作用的靶基因有29个重复，这29个靶基因可能为夏枯草抗乳腺癌的靶点。为研究各靶点在体内的相互作用关系，寻找核靶点，将潜在靶点蛋白群进行PPI 网络分析（见图2），结果共发现29个靶蛋白发生相互作用，产生220条代表蛋白之间相互作用的边。

2.5  核心靶点分析结果

Cytoscape计算得到，PPI 网络平均度值为13.11，平均介数为2.18×10-2，平均紧密度为0.56，度值、介数和紧密度均超过平均值的靶蛋白共7个，说明以上7个靶点在PPI 网络中处于关键位置，很可能是夏枯草抗乳腺癌的关键靶点（图3）。此外，发现夏枯草的19种活性成分中的17种活性成分可能有抗乳腺癌的作用，且其中M1、M2、M6、M10、M11、M13、M19这7种活性成分可能是抗乳腺癌的关键化合物。见图4和表2。

2.6  Metascape分析的KEGG和GO 结果

按照P值（校正）<0.01的标准，运用Metascape数据库对7个关键靶点计算分析，得到关键靶点的相关通路信息。包括乳腺癌通路、子宫内膜癌通路、膀胱癌通路、内分泌抵抗通路、转录因子家族中AP-2 （TFAP2）的转录调控、上皮细胞增殖通路、PIP3激活AKT信号通路、雌二醇应激通路等。见图4。

3 讨论

本研究采用网络药理学的方法对夏枯草的主要活性成分、作用靶点、相关生物信号通路和乳腺癌等几方面的关联性进行了探讨。通过TCMSP 数据库和文献检索共发现夏枯草的主要活性成分19个。其中Beta-sitosterol， Kaempferol， Spinasterol， Stigmasterol， Delphinidin， Luteolin， Morin， Vulgaxanthin-I， Poriferasterol monoglucoside_qt， Stigmast-7-enol，Quercetin， Betulinic acid， Ursolic acid， Rosmarinic acid， Hyperoside， Oleanolic acid， Rutin，Hesperidin， Wogonin可能是夏枯草发挥药效的主要活性物质。检索乳腺癌相关基因，并与夏枯草活性成分作用靶点进行比对，得到29个重复的基因，17种活性较好的化合物，采用Cytoscape软件计算得到抗乳腺癌的主要成分为Beta-sitosterol， Kaempferol， Luteolin， Morin， Quercetin， Ursolic acid， Wogonin等7种;得到7个关键靶点，即CCND1， EGFR， ERBB2， ESR1， MYC， PTEN和TP53。对关键靶点进行富集，得到夏枯草抗乳腺癌的关键信号通路为乳腺癌通路、内分泌抵抗通路、转录因子家族中AP-2 （TFAP2）的转录调控、上皮细胞增殖通路、PIP3激活AKT信号通路、雌二醇应激通路等，推测夏枯草可能通过作用于相关的靶点从而影响相关的信号通路而发挥药效。从网络药理学角度探讨并揭示了夏枯草的主要活性成分、作用靶点、相关生物信号通路和乳腺癌的关系，为进一步研究夏枯草的作用机制提供理论依据。

乳腺癌是女性高发的恶性肿瘤，女性乳腺癌死亡比例占癌症死亡总数的11.6%，是仅次于肺癌的第二大癌症。仅2018年，全球女性乳腺癌新增病例就达210万，且乳腺癌的发病率依旧在不断攀升[26]。在我国，乳腺癌是45岁以下女性肿瘤死亡的最主要原因，且发病率以每年2%～3%的速度增长[27]。因乳腺癌的病因和发病机制都很复杂，临床上针对乳腺癌的治疗主要以放化疗和手术切除等为主。而中医药治疗或辅助治疗疾病有其独特的优势。因此，探索古医术中有记载的中药治疗疾病的作用及机制对医学的发展有着非常重要的作用。

课题组前期研究表明，夏枯草的化学成分能抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖[28-30];吴元肇等[31]研究表明夏枯草口服液能诱导雌激素受体阳性的乳腺癌细胞的凋亡;徐华影等[32]研究表明夏枯草活性成分能抑制乳腺癌细胞的迁移。此外，夏枯草制剂或以夏枯草为主的复方制剂在临床上使用很广泛且有明显的疗效，如夏枯草片剂和口服液用于治疗女性乳腺炎[33]，夏枯草片加逍遥丸可治疗乳腺增生和乳腺纤维瘤[34]，但夏枯草抗乳腺癌的作用及机制均无系统的研究报道。

此外，已有文献报道从茴香中提取的beta-sitosterol能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞的转移[35]，且有研究表明beta-sitosterol可作为乳腺癌的雌激素受体α的潜在抑制剂[36];kaempferol能促进乳腺癌细胞的凋亡[37];luteolin能有效抑制乳腺癌细胞的增殖[38];Quercetin纳米脂质载体能在乳腺癌化学预防中有很好的应用前景[39];Ursolic acid为潜在的抗乳腺癌化合物[40];Wogonin可通过抑制PI3K/Akt/NF- B信号通路而抑制LPS诱导的肿瘤血管新生[41]。

本研究的结论仍存在一定的局限性，因为本研究仅依托数据库，通过数据检索来对药物的功效进行预测，因此，还需要进行实验研究来验证;仅以OB和DL作为活性化合物筛选的指标有一定的局限性，所以在化合物筛选时，也考虑多个中药数据库和文献检索。本研究仅为中药科研提供一个思路，仍需通过系统的实验研究进一步证实。

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