固相微萃取-高效液相色谱联用富集检测1-羟基芘的方法研究

郭思依　杨成

[摘要]建立一种固相微萃取-高效液相色谱联用富集检测1-羟基芘的方法。通过优化萃取温度、萃取时间、搅拌速率、离子强度和静态解吸时间等参数，得到石墨烯纤维对1-羟基芘萃取富集的最优条件为30℃下以500rpm转速萃取30min，加入氯化钠浓度10%（W/V），并于200μL甲醇中静态解吸2min。1-羟基芘富集的回归方程为Y=3.074×106X+214 223，线性范围为1～1 000pg/mL，LOD和LOQ分别为0.3pg/mL和1pg/mL，精密度为3.6%～5.8%。实际样品中1-羟基芘检出浓度为5.61～55.63pg/mL，加标回收率为80.8%～105.2%，RSD值均小于10%，该方法具有较好的灵敏度和准确度。

[关键词]固相微萃取;高效液相色谱;1-羟基芘;富集

中图分类号：O657.63;TS255.7 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.201909

多环芳烃是一类芳香族环境致癌物，广泛存在于大气、土壤、水源以及食品中。食品受到环境污染或者不当的烹饪方式，均会导致多环芳烃的产生。人们通过呼吸、饮食等途径接触多环芳烃后令其参与人体代谢过程[1-2]。1-羟基芘是芘的代谢产物，人体代谢物中的1-羟基芘是多环芳烃的一个灵敏有效的生物监测指标[3-4]。

1-羟基芘的检测方法，主要采用高效液相色谱-荧光检测（HPLC-FLD）、液质/气质联用法等[5-7]。由于基质的复杂性，因此在色谱检测之前合适的前处理过程是十分必要的。目前报道的前处理方法有固相萃取、磁固相萃取、双水相萃取等。丁昌明等[8]采用Envi-18固相萃取小柱对尿样酶解液进行富集净化，利用液相色谱串联质谱检测9种多环芳烃代谢物;黄维等[9]利用十八烷基膦酸改性的磁性介孔纳米粒子为磁固相萃取介质，对尿样酶解液进行萃取，经液相色谱分析;朱裕穗等[10]建立了乙腈-（NH4）2SO4双水相提取，液相色谱-荧光检测尿样中羟基多环芳烃的方法，检出限在0.06～2.32ng/mL。固相微萃取技术集采样富集检测于一体，过程更为简单高效、绿色环保，但未见其对1-羟基芘的富集报道。

文章利用自制石墨烯固相微萃取纤维结合高效液相色谱富集检测1-羟基芘。石墨烯表面的超大π电子体系与1-羟基芘之间存在π-π共轭和疏水相互作用，可高效富集目标物。

1材料与方法

1.1实验材料

1-羟基芘标准品和氯化钠：上海阿拉丁试剂公司;甲醇为色谱纯：赛默飞世尔科技（中国）有限公司;实验用水为纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司;HP-2型β-葡萄糖醛酸酶：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司;盐酸、冰醋酸、醋酸钠为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。取10mg 1-羟基芘溶于10mL甲醇中配成1 000mg/L标品储备液存于4℃冰箱，标准工作液由储备液稀释得到，现配现用。

1.2 实验仪器

Waters e2695高效液相色谱仪（配2475荧光检测器）：美国沃特世公司;250μL内插管：安捷伦科技（中国）有限公司;ST3100实验室pH计：奥豪斯仪器（常州）有限公司;DF-101S集热式数显恒温磁力搅拌器：山东鄄城华鲁电热仪器有限公司;5810R多功能台式离心机：德国艾本德公司;SY-2230恒温水浴摇床：上海珂淮仪器有限公司。

1.3 高效液相色谱条件

高效液相色谱检测采用Waters e2695高效液相色谱仪（配2475荧光检测器），进样量20μL，流速1mL/min，色谱柱：XBridge C18（4.6×250mm，5μm），柱温25℃，流动相为水-甲醇（25：75，V/V）。激发波长（λex）345nm，发射波长（λem）388nm，等度洗脱15min。

1.4 固相微萃取条件优化

吸取50μL 1-羟基芘标准工作液至萃取小瓶中，用水稀释至10mL，盖上隔膜瓶盖置于恒温水浴锅中。考察萃取温度（20℃，30℃，40℃，50℃，60℃），萃取时间（10min，20min，30min，40min，50min），搅拌速率（300rpm，400rpm，500rpm，600rpm，700rpm）、盐离子浓度（0%、5%、10%、15%、20%，W/V）和静态解吸时间（1min，2min，3min，4min，5min）对1-羟基芘富集效率的影响。萃取完成后，将纤维头拉回进样器内，立即导入装有200μL甲醇的内插管中静态解吸后，进液相色谱仪进行检测，检测流程见图1。

1.5 SPME-HPLC方法学评价

为建立1-羟基芘富集標准曲线，配制0.001ng/mL，0.01ng/mL，0.05ng/mL，0.1ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL 1-羟基芘标准工作液进行最优条件下的萃取富集实验。LOD和LOQ分别以3倍、10倍S/N来计算;纤维萃取的重复性（日内、日间精密度）是利用单根纤维分别重复萃取5次和3次得到。

1.6 实际样品的采集与处理

收集5名大学生晨尿，于-20℃下保存。室温下将尿样自然解冻后摇匀，取10mL于50mL离心管中，加入0.2M盐酸溶液，pH值调至5.0，然后加入5mL pH值为5.0的醋酸钠缓冲液和40μL HP-2型β-葡萄糖醛酸酶，充分混匀后在恒温水浴摇床中于37℃下酶解4h。将酶解液经0.45μm滤膜过滤后，取1mL清液至萃取小瓶中用水稀释至10mL进行SPME。

2 结果与分析

2.1 固相微萃取条件优化

2.1.1 萃取温度

本实验考察了20℃～60℃温度下纤维对1-羟基芘的萃取效率变化，见图2。由图2可知，随着温度的升高，1-羟基芘的萃取效率在30℃下达到最大值。当温度继续升高，纤维对1-羟基芘的萃取量反而逐渐降低，表明纤维对1-羟基芘的吸附为放热反应，在较低温度下达到平衡后，升高温度导致分配系数降低从而使得1-羟基芘的萃取量逐渐减小。因此，萃取温度选择在30℃下进行。

2.1.2 萃取时间

萃取时间可以显著地影响萃取量，萃取时间的选择是时间成本与分析方法灵敏度之间的折中。本实验考察了萃取时间为10～50min下纤维对1-羟基芘富集效率的影响，结果见图3，随着时间的延长，纤维对1-羟基芘的萃取量逐渐增大且在30min时基本达到萃取平衡，因此，选择萃取时间为30min。

2.1.3 搅拌速率

萃取体系的搅拌程度对1-羟基芘的富集效率具有一定影响。实验考察了300rpm、400rpm、500rpm、600rpm和700rpm的搅拌速率下纤维对1-羟基芘的萃取效率，结果见图4。由图4可知，增大搅拌速率对1-羟基芘的富集具有先促进后抑制的趋势。在300～500rpm转速下，萃取量随搅拌速率的增大而缓慢增大，当转速为至500rpm时，纤维对1-羟基芘的萃取量达到最大，增大转速有利于目标物向纤维涂层内的转移;当搅拌速率继续增大时（500～700rpm），1-羟基芘萃取量逐渐降低，这与萃取体系的不稳定性相关。因此，SPME体系的最佳搅拌速率为500rpm。

2.1.4 离子强度

在样品溶液中加入氯化钠（0～20%，W/V），考察离子强度对萃取效率的影响，结果见图5。由图5可知，盐离子的加入可以在一定程度上促进纤维对1-羟基芘的萃取吸附，当盐离子浓度增大至10%时达到最佳，原因在于盐离子可与水分子发生水合作用，使得目标物在水中的溶解度降低，有利于向涂层内转移而达到较高的萃取量;然而，继续增大盐离子浓度后，实验发现1-羟基芘的萃取量反而有所降低，原因在于较多的Na+和Cl+会与目标分析物发生竞争吸附，从而导致萃取量降低。因此，选择10%的盐离子浓度为最佳实验条件。

2.1.5 解吸时间

在SPME过程结束后，将纤维头拉回微量进样器内，迅速插入装有200μL甲醇的内插管中进行溶剂解吸。考察解吸时间（0.5～2.5min）对1-羟基芘富集效率的影响，结果见图6。实验表明，1-羟基芘的检出量随解吸时间的延长而缓慢增大，当解吸时间达到2.0min之后，1-羟基芘峰面积不再增大，纤维所富集的1-羟基芘量能够解吸完全。因此，在甲醇中的解吸时间选择2.0min。

2.2 1-羟基芘标准曲线的制备及方法学评价

在最优SPME实验条件下，利用纤维对1～10 000

pg/mL梯度范围内的1-羟基芘标准溶液进行萃取富集，以质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。实验发现，线性范围为1～1 000pg/mL;回归方程为Y=3.074×106X+214 223，决定系数R2为0.998 7;以3倍、10倍S/N分别计算LOD为0.3 pg/mL、LOQ为1 pg/mL。为考察纤维萃取的重复性，对1天内独立配制的1-羟基芘标准溶液进行5次测定，得到日内RSD为3.6%，对连续3天独立配制的1-羟基芘标准溶液进行测定，得到日间RSD为5.8%，结果见图7、表1。结果表明，本方法具有较好的重复性。

2.3 本SPME方法与文献方法的比较

本方法是利用自制石墨烯SPME纤维，对酶解液进行SPME富集后经LC-FLD检测。与文献报道的其他1-羟基芘富集检测方法相比，本方法具有更低的检出限和较宽的线性范围，具体见表2，能够满足痕量物质的检测要求。

2.4 实际样品中1-羟基芘的检测及回收率

取5名大學生晨尿，经酶解处理使结合态1-羟基芘水解成游离态后，进行SPME-HPLC富集检测，结果见表3、图8。由表3可知，5名大学生尿样中均有1-羟基芘检出;进行加标回收实验，加标浓度分别为10pg/mL和100pg/mL，得到回收率和相对标准偏差，回收率为80.8%～105.2%，RSD值均小于10%。实验表明，本方法具有较好的灵敏度和准确度。

3 结 论

本章采用自制的石墨烯SPME纤维，通过石墨烯和1-羟基芘之间π-π作用和疏水相互作用等，建立了对1-羟基芘萃取富集的新方法。通过优化实验参数，得到石墨烯纤维对1-羟基芘萃取富集的最优条件为30℃下以500rpm转速萃取30min，加入氯化钠浓度为10%（W/V），并于200μL甲醇中静态解吸2min后，通过液相色谱仪（荧光检测器）进行定量测定。在此最优条件下绘制了1-羟基芘富集的标准曲线，回归方程为Y=3.074×106 X+214 223，决定系数R2为0.998 7，线性范围为1～1000 pg/mL，LOD和LOQ分别为0.3 pg/mL和1 pg/mL。日内、日间的RSD分别为3.6%和5.8%，表明石墨烯纤维的重复性较好。将本方法应用于实际样品检测中，1-羟基芘检出浓度为5.61～55.63 pg/mL，加标回收率在80.8%～105.2%，RSD值均小于10%，方法具有较好的灵敏度和准确度。

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