德克萨斯组铃铛铁线莲胚胎挽救及促进种子萌发技术研究

孙瑞琦 余伟军 曾黎辉

摘要：[目的]研究不同植物生长调节剂配比处理对德克萨斯组铃铛铁线莲打破休眠及胚胎挽救的影响，解决德克萨斯铃铛铁线莲萌发时间过长，高温胁迫引起种子发育中途败育的问题，为提高育种效率，缩短育种周期提供理论依据与指导。[方法]以德克萨斯组铃铛铁线莲‘王梦’为材料，设计12种不同浓度6-BA、NAA的正交试验筛选铃铛铁线莲胚胎挽救最适植物生长调节剂浓度，讨论椰乳作为培养添加物对胚胎挽救的促进作用;比较低温、变温及不同浓度GA、6-BA对打破铃铛铁线莲种子休眠的影响。[结果]将授粉后45d的杂交铃铛铁线莲种子离体培养，MS基本培养基添加0.5mg.L6-BA和0.05mg·LNAA可以使铁线莲胚胎正常发育成熟的成功率达到47%，发芽率为54%;在此基础上培养基中再添加10%的椰乳，种子发育成熟率和发芽率均显著提高到62%。低温处理和光培养25℃/暗培养15℃的温度可以促进铃铛铁线莲种子发芽，配合50mg.LGA或30mg.L6-BA处理打破休眠更加显著。[结论]铁线莲胚可以通过离体挽救解决高温带来的败育问题;植物生长调节剂处理可以显著打破种子休眠，促进萌发。

关键词：铃铛铁线莲;杂交;打破休眠;胚胎挽救

中图分类号：S567文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2019）09-1040-07

0引言

（研究意义）铁线莲Clematis L是毛茛科、铁线莲属中著名的藤本观赏植物，全球共约300余种，我国有110种左右，全国各地都有分布。根据英国皇家园艺协会的分类，目前市场上常见的园艺品种可以分为：全缘组、佛罗里达组、早花大花组、晚花大花组、常绿组、南欧租、德克萨斯组、长辦组和蒙大拿组等。德克萨斯组铁线莲以铃铛花型为主，以其極长的花期和广阔的适应性和强大的抗病能力被广大园艺爱好者所喜爱，但花径较小，不适合作园林绿化材料，其他品系铁线莲花大艳丽而花期主要集中在4-5月，抗病性不强。如果将德克萨斯组铃铛铁线莲同花型大、花量多的大花铁线莲进行杂交，可以增加其观赏价值，在园林绿化中大量应用。（前人研究进展）植物胚是一种多细胞结构，胚胎发育完全成熟，没有任何机械损伤的种子可直接播种成苗。但在杂交育种过程中，获得的合子胚经常在发育中途败育或发生严重退化，导致不能正常出苗，严重影响了育种效率。通过离体培养进行胚挽救，使可以败育或退化的胚正常发育获得和自然成熟一样的种子和再生植株，这种技术在植物育种中具有十分重要的指导与实践意义。导致植物种子休眠的主要原因分为外界环境因素和自身因素两类;外界因素包括：温湿度、光照、空气、土壤微生物等，自身因素又包括种壳束缚、以及种胚未发育成熟等。有机酸、酚类、醛类、亚胺等物质是种子内部抑制发芽萌发的主要成分，这些物质需经过一段时间才能被种子分解代谢，以上几种物质共同造成部分植物种子发芽困艰难。曹昊等研究表明赤霉素处理能够打破东北铁线莲种子的休眠，缩短发芽所需时间，10mg.LGA溶液浸种30min可以明显促进东北铁线莲种子萌发、提高发芽率，当浸种浓度大于50mg.L时种子发芽率降低，表现出一定的毒害现象。因此，铁线莲休眠原因可能也与脱落酸、赤霉素、乙烯等内源激素有关。（本研究切入点）在铁线莲杂交育种中，经常遇到胚胎败育和休眠时间过长的问题，如铃铛铁线莲‘王梦’、‘樱桃唇’杂交授粉成功后，胚胎需要约80d左右才能完全成熟，但是在发育至55d左右，种子完全成熟前会突然败育，导致结实率低，杂交效率不理想。铁线莲种子的萌发温度尽量控制在15℃-25℃。普通铁线莲种子经过1-2次自然低温刺激可能萌发，杂交铁线莲种子需要2-3年甚至更久才能萌发。铃铛铁线莲杂交胚胎败育的具体原因和打破休眠的研究尚未见报道。（拟解决的关键问题）本试验以德克萨斯组铃铛花型铁线莲‘王梦’为材料进行胚胎挽救和打破种子休眠的初步探索，以期为德克萨斯组铁线莲的繁殖及杂交育种提供技术支持。

1材料与方法

1.1 试验材料

供试种子均采自福建农林大学园艺遗传育种教研室种质资源圃5年生德克萨斯组铃铛铁线莲‘王梦’。胚挽救试验种子采用‘王梦’为母本与‘樱桃唇’为父本的杂交种子。打破休眠试验种子采用‘王梦’自花授粉的成熟种子。

1.2 试验方法

1.2.1 种子百粒重、相对含水量和吸水率的测定随机取种子100粒，用电子天平称重（精确至0.0001g），重复3次，然后计算平均值，由此得出‘王梦’种子的百粒重。随机取种子100粒，用60℃烘箱烘至恒重。重复3次，用下列公式计算种子的相对含水量：种子的相对含水量（%）=（100粒种子原重-千重）/100粒种子原重×100%。随机取种子100粒，浸泡于水中，直至重量不再变化，称重。重复3次，用下列公式计算种子的吸水率：种子的吸水率（%）=（100粒种子吸水后重量-100粒种子原重）/100粒种子原重×100%。

1.2.2胚胎挽救 采集父本刚开放花朵的花药，收集花粉，放人培养皿中备用;母本半开放时，轻轻拨开花苞，将雄蕊拔除。用毛笔蘸取花粉，均匀涂抹到柱头上。对授粉的花进行套袋标记父本母本和授粉日期。未完成双受精过程的胚直接败育（图1），正常完成双受精过程的胚生长到45d时剥去外种皮可观察到绿色饱满的种仁（图2），将其放入培养瓶中，加入洗衣粉搓洗10min，再用自来水冲洗60min，在超净工作台中用0.1%HgCl消毒8、10、12、15min后接人空白MS培养基中，5d后观察褐变、污染情况，筛选最适消毒时间。

把无菌的种子分别接人不同浓度的6-BA和NAA的培养基中培养40d后观察种子发育情况，研究不同植物生长调节剂浓度对铁线莲胚胎发育的影响;以6-BA和NAA培养基为基础，附加10%的椰乳，观察椰乳对铁线莲胚胎发育的影响。每个处理为20粒种子，重复3次。培养基均以MS为基本培养基，添加蔗糖30g.L，pH值6.0，培养温度（25±2）℃，光照时间16h·d，光照强度4000lX。

将发育成熟的种子播种到光培养25℃，暗培养15℃的人工气候箱中（基质为泥炭和珍珠岩，体积比3：1），60d后观察统计发芽情况。

发育率=种胚发育成熟数/接种数×100%

发芽率=发芽数/发育成熟数×100%

1.2.3打破种子休眠 将植株上成熟的种子采收后剥去外种皮，对照直接播种于基质中（泥炭珍珠岩体积比3：1）在田间自然状态下萌发;处理1将种子放人蒸馏水中在4℃冰箱中放置1月后播种于基质中放入田间自然状态下萌发;处理2直接播种于基质中放置于人工气候箱内（光培养25℃/暗培养15℃）萌发，分别观察低温和昼夜温差处理对铃铛铁线莲种子萌发的影响，每个处理为20粒种子，重复3次。40d后观察统计萌发率。

在上述研究基础上，以经过低温+昼夜温差处理的种子为对照，研究GA和6-BA处理对打破铃铛铁线莲种子休眠的影响。将植株上成熟的种子采收后剥去外种皮，放人蒸馏水中在4℃冰箱中放置1周后取出搓洗干净未剥下的外种皮，吸干水后放人组培瓶，在4℃冰箱中再静置3周后，将种子取出分别放人5、20、30、50、80mg.LGA或5、20、30、50、80mg.L6-BA中浸泡4h。取出种子用蒸馏水冲洗干净后播入经过高压消毒过泥炭土与珍珠岩混合（体积比3：1，含水量75%）的基质中，覆膜，再放人人工气候箱（光培养25℃/暗培养15℃）。每处理20粒种子，重复3次。40d后观察统计萌发率。

2结果与分析

2.1 铁线莲‘王梦’种子百粒重、相对含水量、吸水率的测定

百粒重直观的反映种子的品质，种子贮藏的营养物质越多，百粒重越大。胚胎挽救取材于未成熟种子，种子百粒重可以帮助预估胚胎挽救培養时间。测定结果表明铁线莲‘王梦’的种子百粒重为（2.672±0.013）g。有报道褐毛铁线莲的百粒重为（1.359±0.001）g，林地铁线莲的百粒重只有（0.133±0.004）g，与其他铁线莲相比，‘王梦’的种子重量较大。

种子萌发与种子含水量关系密切，向日葵种子在含水量6%-7%时，短时间内即可发芽，当含水量在低于5.5%或高于7.5%时种子进入休眠状态，较难萌发，褐毛铁线莲种子的相对含水量为（9.33±0.01）%，棉团铁线莲的相对含水量为（13.67±0.15）%，铁线莲‘王梦’的种子相对含水量为（18.50±0.01）%，与其他铁线莲相比，相对含水量也较高。

2.2 不同消毒时间对铁线莲种子的影响

铃铛铁线莲种子褐变呈乳白色。根据表1可以看出随着消毒时间的增加，铁线莲种子的褐变率逐渐升高，污染率逐渐下降。在消毒15min时，63.33%种子都出现褐变情况，但消毒较为彻底。在消毒8min时，褐变率最低，污染率最高。消毒时间控制在10-12min内可以得到较低的褐变率和污染率。

2.3 不同植物生长调节剂组合对铁线莲种子胚胎发育的影响

胚胎挽救培养基配方及发育发芽情况如表2所示。在培养20d后可凭肉眼观察到种子是否正常发育.正常发育的种子颜色呈浅棕色。厚度均匀，子叶饱满，种胚发育完好，没有干瘪也没有过度膨大，外形颜色均与自然成熟种子无异（图3）。没有正常发育的种子呈乳白色，少数深褐色，种仁异常膨大或干瘪呈败育状态，内部充满水分（图4-5）。正常发育种子和败育种子对比（图6），发育成熟播种后发芽（图7）。

植物胚胎挽救所需的植物生长调节剂浓度总体较低，不同6-BA和NAA的浓度配比对铁线莲胚胎挽救影响差异较大。从表2可以看出，低浓度的6-BA和NAA对铃铛铁线莲胚的发育率和发芽率影响较小，随着2种植物生长调节剂浓度的增加，胚的发育率和发芽率也逐渐上升。0.5mg.L6-BA与0.05mg·LNAA等比例混合使用可以使铁线莲胚胎正常发育成熟的成功率达到46.66%，同时使发芽率保持在53.57%。6-BA对胚胎挽救发芽率影响比较明显，而不同水平的NAA对铁线莲胚胎挽救的发芽率影响不显著。培养基中添加椰乳后，明显提高种子的发育率和发芽率，0.5mg.L6-BA+0.05mg.LNAA+10%椰乳培养基中的种子的发育率和发芽率均达到最高。

2.4 不同处理对铁线莲种子萌发的影响

由表3可见，仅低温处理或昼夜温差处理的部分种子在播种后40d可以发芽，但萌发率较低。由表4可见，结合6-BA或GA处理的种子发芽率随着处理浓度增加均呈现先升后降的趋势，低浓度的GA和6-BA对铃铛铁线莲种子的萌发均无明显的促进作用，在植物生长调节剂浓度过高时反而对种子的萌发起抑制作用。50mg·LGA处理的种子发芽率达到了76.66%，30mg.L6-BA处理的种子发芽率最高，达到了81.66%。未经任何处理的铃铛铁线莲从2018年7月3日采收播种到10月21日开始发芽需要108d，而30mg·L6-BA低温处理的种子在70d时（30d低温处理+40d发芽）发芽率达81.66%且发芽时间缩短38d。

3讨论与结论

胚的活体转移、活体培养和离体培养，是迄今为止已有报道的3种植物幼胚拯救方法。幼胚、败育胚、退化胚等都可以作为胚胎挽救的材料.影响植物胚胎挽救成功率的因素主要有培养温湿度、生长调节剂配比、胚发育情况、基本培养基、培养方法、其他培养基添加物等。其中椰乳作为一种常用的培养基添加剂对胚的离体培养有重要的作用。陈容茂等发现在培养基中添加10%椰乳，可促进龙眼胚状体发育正常，甚至经过一段时间培养可以直接萌发。添加椰乳对杂交东方百合幼胚离体培养成活率也有明显的促进作用。可能是由于椰乳中含有MS培养基不能提供的种胚生长发育所必须的营养物质。

在田间栽培过程中发现铃铛铁线莲种子自然发育成熟需要80d左右。四月初杂交授粉，正常完成双受精过程的胚生长到45d时，发育正常，种仁饱满，外种皮较软，内种皮发育完全，此后种子陆续开始败育。本试验主要探究正常胚体外培养的可行性，遂在种子发育至45d时取材进行胚胎挽救。实验全部过程均在2018年内完成，但在2019年栽培中发现：5月整体气温较低，铁线莲种子生长状况良好，未出现败育情况。查询历史天气可知：2019年5月平均高温24℃，平均低温17℃，而2018年5月平均高温32℃，平均低温22℃，≥33℃以上的高温天气达到15d，且气温变化幅度较大，这很可能是导致胚败育的原因.高温引起导致植物败育的机制只在棉花、水稻中有相关研究，花卉方面未见报道。经过胚胎挽救培养的铃铛铁线莲种子成熟后播种60d的萌发率可以达到62%且发芽时间比自然状态萌发提前40d左右。目前的胚胎挽救技术主要集中核果类果树方面，花卉中只有月季、菊花等有少许研究。本研究验证了铁线莲未成熟种子进行胚胎挽救的可行性，筛选了较优消毒时间和植物生长调节剂配方，为提高铁线莲杂交育种效率，培育新品种创造条件。

完全成熟的种子ABA含量最高。ABA与GA对植物种子萌发的影响完全相反。种子萌发困难的原因是种子休眠时内部ABA含量升高，高浓度的ABA促进种子休眠以便种子安全度过逆境;当极端天气结束，萌发环境适宜时，种子内部ABA含量降低，GA浓度逐渐升高，这种激素浓度的动态变化打破种子休眠，促进种子在适宜的环境和时间节点萌发。三因子学说的观点认为：种子休眠和萌发的原因是种子内部萌发促进物和抑制物的动态变化。萌发抑制物可以消除细胞分裂素和生长素的对萌发的促进作用，随着种子萌发过程的进行，种子内部激素的动态变化大致为赤霉素、细胞分裂素和生长素的浓度在逐渐升高以及脱落酸的降低。赤霉素可代替低温处理解除种子休眠，罗登攀的研究表明用250mg.LGA浸种6h可以显著促进腊梅种子的萌发。6-BA是人工合成的细胞分裂素类物质，它的作用是细胞分裂和横向增粗，提高种子发芽率，促进种子发芽。20mg.L的6-BA对五指茄萌发、生根都有较好的促进作用。本试验通过研究低温、昼夜温度变化、以及不同浓度植物生长调节剂（6-BA、GA）对打破铃铛铁线莲种子休眠、促进萌发的影响。结果表明低温和光培养25℃/暗培养15℃昼夜温差处理可以适当促进铃铛铁线莲的萌发，这2种处理配合6-BA、GA對促进铃铛铁线莲萌发效果更加明显。通过人工可控环境打破种子休眠，促进提早萌发，是缩短铁线莲育种周期的有效手段。