PRA法检测hsp65和groES在非结核分枝杆菌肺病诊断中的价值

章 洁，郭秋萍

(广元市第三人民医院检验科，四川广元 628001)

我国非结核分枝杆菌肺病的发病率逐年上升，而结核病的比例却逐年下降[1]。Meta分析显示，我国以鸟-胞内分枝杆菌复合体肺病最为常见[2]。如今，根据抗酸杆菌涂片的结核分枝杆菌实验室诊断可在24 h内产生结果[3]。然而，涂片对结核分枝杆菌不是非常特异，并且每毫升痰需要103～104个菌[4]。SAIFI等[5]通过PCR-限制性片段长度多态性分析(PRA)法对分枝杆菌扩增hsp65基因后使用BstEⅡ消化发现，结核分枝杆菌只能产生245 bp/120 bp/80 bp的片段，而非结核分枝杆菌则产生多种片段。ARAVINDHAN等[6]研究发现，结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的groES基因扩增后用BstNⅠ消化产生片段不同。本研究采用PRA法对hsp65和groES进行检测，以评估其对非结核分枝杆菌肺病的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年2月至2018年2月本院收治的非结核分枝杆菌肺病患者30例作为肺病组，男18例，女12例，平均年龄(41±16)岁。选择结核病患者30例作为结核组，男14例，女16例，平均年龄(39±18)岁；其中HIV/AIDS合并结核病患者13例，非HIV/AIDS合并结核病患者17例；肺结核病11例，肺外结核病19例。病理科按照中华医学会结核病分会的标准进行诊断，30例非结核分枝杆菌肺病患者和结核病患者均确诊[7-8]。选择非结核分枝杆菌病感染患者30例作为感染组，男15例，女15例，平均年龄(37±13)岁；经皮肤试验阳性但无非结核分枝杆菌入侵组织和器官的现象。另选择2017年6月至2018年2月本院体检健康者30例作为健康对照组，男15例，女15例，平均年龄(45±14)岁。4组研究者年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有均衡可比性。本研究经本院伦理委员会批准，且受试者均知情同意。

1.2方法

1.2.1痰液中DNA的提取 收集肺病组、结核组和健康体检组受试者清晨痰液样本各5 mL，采用支气管镜采样。使用最终1%浓度的NaOH通过Nacl-NaOH方法隔天对样本净化15 min。去污后，所有标本均为用磷酸盐缓冲液中和，并以4 000×g离心15 min。将离心后得到的沉淀物重新悬浮于2 mL LJ培养基中，37 ℃培养过夜后(培养2次均为同一致病菌且抗酸杆菌涂片阳性度为++以上)，使用厦门慧嘉生物科技有限公司的Amresco基因组DNA提取试剂盒(货号：K368-50RXN)进行DNA的抽取。

1.2.2PCR试验 PCR的最终体积为25 μL，由5 μL DNA，200 μmol/L脱氧核苷三磷酸(dNTP)，每种引物25 pmol，1.5 mmol/L MgCl2,1.25 U Taq DNA聚合酶(众红生物，货号：ZHR1007M)组成，加入10×PCR缓冲液后将反应混合物在94 ℃下初始变性5 min，然后进行35个扩增循环(94 ℃ 60 s，60 ℃ 60 s和72 ℃ 60 s)。最终延伸在72 ℃下进行10 min。PCR引物由上海生工合成，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3DNA酶消化 采用BstE Ⅱ(NEB，货号：R0162L)对hsp65基因的扩增产物进行消化，BstN Ⅰ(NEB，货号：R0168L)对groES基因的扩增产物进行消化。将消化的产物在3%琼脂糖凝胶电泳上，100 V下进行2 h。扩增hsp65基因后使用BstEⅡ消化发现结核分枝杆菌只能产生245 bp/120 bp/80 bp的片段，而非结核分枝杆菌则产生多种片段(245 bp/220 bp,245 bp/120 bp/100 bp,325 bp/120 bp)[5]。扩增groES基因后使用BstN Ⅰ消化发现结核分枝杆菌能产生多种片段(550 bp/50 bp,470 bp/80 bp/50 bp,310 bp/140 bp/50 bp)，而非结核分枝杆菌则只能产生500 bp/100 bp的片段[6]。基于此，使用Image J软件对琼脂糖凝胶成像图中的条带进行灰度值分析。条带数据化后，将[(325 bp+220 bp+100 bp)/80 bp]定义为非结核分枝杆菌hsp65相对分子质量，将(50 bp/100 bp)定义为非结核分枝杆菌groES相对分子质量。

2 结 果

2.14组受试者痰液中hsp65和groES的相对分子质量 肺病组患者痰液中hsp65和groES的相对分子质量明显高于结核组、感染组及健康对照组(P<0.05)。健康对照组中hsp65和groES的相对分子质量明显低于感染组、结核组(P<0.05)。感染组患者痰液中hsp65和groES的相对分子质量明显高于结核组(P<0.05)。见表2。

2.2肺病组与结核组患者痰液中hsp65和groES的诊断效能 绘制30例非结核分枝杆菌肺病患者与30例结核病患者的ROC曲线，见图1。hsp65的ROC曲线下面积为0.92(95%CI：0.851 4～0.986 4)，以hsp65=2.83为阳性临界值，其诊断灵敏度为93%，特异度为80%。groES的ROC曲线下面积为0.91(95%CI：0.830 4～0.987 4)，以groES=2.67为阳性临界值，其诊断灵敏度为77%，特异度为90%。见表3。

表2 4组受试者痰液中hsp65和groES的相对分子质量

注：与结核组、感染组及健康对照组比较，▲P<0.05；与感染组及结核组比较，*P<0.05；与结核组比较：△P<0.05

图 肺病组与结核组患者痰液中hsp65和groES的ROC曲线

检测变量灵敏度(%)特异度(%)临界值曲线下面积P95%CIHsp6593802.830.92<0.000 10.851 4～0.986 4groES77902.670.91<0.000 10.830 4～0.987 4

2.3肺病组与感染组患者痰液中hsp65和groES的诊断效能 绘制30例非结核分枝杆菌肺病患者与30例非结核分枝杆菌感染患者的ROC曲线，见图2。hsp65的ROC曲线下面积为0.73(95%CI：0.609 3～0.859 5)，以hsp65=3.17为阳性临界值，其诊断灵敏度为77%，特异度为63%；groES的ROC曲线下面积为0.72(95%CI：0.580 1～0.862 1)，以groES=2.96为阳性临界值，其诊断灵敏度为77%，特异度为96%。见表4。

2.4肺病组与健康对照组痰液中hsp65和groES的诊断效能 绘制30例非结核分枝杆菌肺病患者与30例体检健康者的ROC曲线，见图3。hsp65的ROC曲线下面积为0.90(95%CI：0.831 3～0.982 1)，以hsp65=2.27为阳性临界值，其诊断灵敏度为93%，特异度为83%。groES的ROC曲线下面积为0.89(95%CI：0.815 7～0.979 8)，以groES=1.96为阳性临界值，其诊断灵敏度为76%，特异度为87%。见表5。

图2 肺病组与感染组患者痰液中hsp65和groES的ROC曲线

检测变量灵敏度(%)特异度(%)临界值曲线下面积P95%CIHsp6577633.190.730.001 80.609 3～0.859 5groES63962.960.720.003 30.580 1～0.862 1

图3 肺病组与健康对照组痰液中hsp65和groES的ROC曲线

检测变量灵敏度(%)特异度(%)临界值曲线下面积P95%CIHsp6593832.270.90<0.000 10.831 3～0.982 1groES76871.960.89<0.000 10.815 7～0.979 8

3 讨 论

世界各地医院均报道过与被污染的器械有关的非结核分枝杆菌感染暴发[9]。皮肤和免疫抑制患者的非结核分枝杆菌很容易向肺部或淋巴结系统扩散[10]。自20世纪80年代以来，非结核分枝杆菌疾病模式和流行病学已发生变化，并逐渐出现在未被认识的人群中[11]。 非结核分枝杆菌越来越被认为是重要的人类病原体，由于艾滋病和其他免疫缺陷疾病，非结核分枝杆菌引起的疾病流行正在上升，且物种逐渐多样化[12]。非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌复合体成员的区别在于它们不是专性病原体[13]。虽然抗酸杆菌涂片能够在24 h内诊断出结核分枝杆菌，但是涂片对结核分枝杆菌不是非常特异，并且每毫升痰需要103～104个菌[3-4]。另一方面，随着全世界非结核分枝杆菌感染频率的增加，临床医生对非结核分枝杆菌疾病的认识提高，导致对非结核分枝杆菌感染的诊断有更多要求[14]。已有研究报道使用PRA法可以区分4种M.chelonae、M.fortuitum、M.kansasii和M.scrofluaceum，它们是临床上最重要的非结核分枝杆菌[15]。尽管目前发现有154种非结核分枝杆菌，但是除了这4种非结核分枝杆菌，其他非结核分枝杆菌在临床上并不常见或致病性低。由于PRA法诊断的快速性、便捷性和普遍性，本研究忽略PRA法检测到其他非结核分枝杆菌的DNA片段。基于此，本研究发现，PRA法检测hsp65和groES在非结核分枝杆菌病诊断中的临界值分别为2.27和1.96，且具有较好的效果。

编码10×103(GroES)和60×103(GroEL)热休克蛋白的groESL操纵子在细菌中普遍存在并且在进化上保守[16]。分枝杆菌的Hsp65(GroEL2)基因因其在物种鉴定中的实用性而得到充分证明[17]。 Hsp10(groES)基因(Rv3418c)因具有高度保守的氨基酸序列，已鉴定出免疫显性物种特异性T细胞和B细胞表位并已用于免疫诊断[18]。本研究中使用了439和600 bp的靶DNA序列，发现肺病组患者痰液中hsp65和groES相对分子质量明显高于结核组、感染组及健康对照组(P<0.05)。439 bp 的hsp65基因和600 bp的groES基因标记是特异性的[19]，具有更广谱的检测，可从所有分枝杆菌(包括非结核和非致病)物种中扩增，扩增hsp65基因后使用BstEⅡ消化发现结核分枝杆菌只能产生245 bp/120 bp/80 bp的片段，而非结核分枝杆菌则产生多种片段(245 bp/220 bp,245 bp/120 bp/100 bp,325 bp/120 bp)[5]。扩增groES基因后使用BstN Ⅰ消化发现结核分枝杆菌能产生多种片段(550 bp/50 bp,470 bp/80 bp/50 bp,310 bp/140 bp/50 bp)，而非结核分枝杆菌则只能产生(500 bp/100 bp)[6]。肺病组与结核组的hsp65和groES的灵敏度分别为93%和77%，特异度分别为80%和90%；肺病组与感染组的hsp65和groES的灵敏度分别为77%和63%，特异度分别为63%和96%；肺病组与健康对照组的hsp65和groES的灵敏度分别为93%和76%，特异度分别为83%和87%。

4 结 论

PRA法检测hsp65和groES在非结核分枝杆菌肺病诊断中具有较好的效果。