污染场地土壤生物毒性测试方法研究进展

2019-09-10范雅伦付融冰

四川环境 2019年4期

殷娟，范雅伦，李倩，付融冰，陈玲

(同济大学环境科学与工程学院，上海 200092)

1 前言

污染场地被视为潜在的污染源，不仅会对土壤生态系统产生不利影响，还可能引发地下水污染。污染场地土壤的风险评估，传统方法是利用化学分析手段测定污染物的总量，再与规定的标准值进行比较，从剂量-反应关系评估其危害。但高的总浓度并不总能转化为高迁移性、生物利用性和毒性[1-2]，因此单纯依靠化学分析手段有可能会高估场地的污染情况。同时，我国土壤环境质量标准仅制定了有限环境项目的管控标准，难以对不同污染类型场地的污染程度做出准确评价。而生物毒性测试方法可有效弥补化学分析方法的局限性，反映污染物质对生物体的综合效应，为特定场地的实际生态风险评估给予技术支撑。

2 生物毒性测试方法

2.1 陆生生物毒性测试方法

陆生生物毒性测试方法能够直接接触环境毒性，被视为诊断场地污染物生物可利用部分危害的有用工具[3-4]。表1归纳了目前比较常用的生物毒性测试方法，表明不同的受试生物、毒性终点对不同污染类型的土壤表现出不同的敏感性。具体介绍如下：

表1 陆生生物毒性测试方法Tab.1 Terrestrial biological toxicity test methods

2.1.1 高等植物法

高等植物测试方法被视为评价污染土壤质量的重要方法，尤其当有植物毒性相关污染物存在时，植物测定就更为相关[5-6]。小麦、白菜、萝卜、莴苣等具有较高经济价值的作物常被用于毒性测试，较为成熟的测试方法主要有根伸长抑制、种子萌发和植物早期生长等。根系由于直接与土壤接触，通常可以快速灵敏地反映污染物的生态毒性，而且许多研究发现植物的根生长抑制通常比种子萌发更为敏感[7-8]。高等植物测试方法操作简单、成本低，作为生产者其生长状况是评价土壤质量的重要指标。但植物生长过程容易受到其他因素的影响，且测试时间长(至少需一周左右时间)，因此不建议用于场地污染的快速诊断。

2.1.2 陆生无脊椎动物法

陆生无脊椎动物物种丰富，相对容易采样，并且可以快速响应土壤干扰[9]。对于土壤污染，蚯蚓因其与土壤的紧密接触及其在陆地食物网中的重要性而被广泛用作试验物种。除蚯蚓外，其他动物物种如鞘翅目、弹尾虫、螨虫、等足类动物、线虫和原生动物等在土壤生态毒性评估中也显示出良好的潜力[10]。主要的测试终点有死亡率、生长发育相关指标(如体重损失)、繁殖及回避行为等[3，11～13]。生物标志物如超氧化物歧化酶活性、活性氧水平、脂质过氧化水平和DNA损伤程度等也越来越多地用于生态毒理学[13-14]。在较低层次的生态风险评估中，回避试验(测试周期 < 48h)作为早期筛选工具具有很大的潜力，因为它们敏感、成本效益高且具有生态相关性。而且Gainer等人发现[15]在受石油烃污染的土壤中，土壤无脊椎动物的回避行为能够达到与敏感植物物种生长测量对污染物相似的响应范围。但是陆生无脊椎动物法也有一些局限性，如试验成本较高、需要特殊仪器装置等。

2.1.3 土壤微生物法

作为生态系统的重要组成部分之一，微生物常被用来评估重金属或农药(如除草剂)污染土壤的毒性[16～18]。尤其是对于重金属污染而言，土壤微生物比其他陆地生物对金属浓度升高更敏感[19]。微生物测试方法常用的毒性指标包括土壤呼吸、土壤酶活性以及群落水平上的微生物生物量、群落结构多样性、活性等。相比于植物和动物，在技术层面上来说微生物方法最易实现对群落水平的研究。一些先进的分子生物学方法如基因芯片、高通量测序(Illumina平台)、变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)等也逐渐应用到生态毒理学领域中。如Romdhane等人[16]以细菌的群落多样性和活性为测试终点来评价除草剂的生态毒性，结果发现基于16S rRNA的高通量测序与代谢组学方法的结合是评估和比较天然和合成三酮对土壤细菌群落的生态毒理学影响的有力方法。与植物和动物法相比，微生物法操作简便、试验周期短、有良好的重现性，但鉴于不同土壤中微生物群落结构与数量不同，对污染物的灵敏度不尽相同，导致不同类型场地土壤的测试结果无法进行比较。

2.2 水生生物毒性测试方法

考虑到水体部分是大多数土壤污染物的最终受体，需要采用更全面的方法来评估其与陆地环境的相互作用。常用的如鱼类毒性测试、发光菌毒性测试以及大型蚤(Daphniamagna)毒性测试等方法列于表2。比较发现，在鱼类毒性试验中，斑马鱼(Daniorerio)由于繁殖快、易于饲养和世代时间短等优点，成为生态毒理学研究中的一种理想模式生物。而与成鱼相比，斑马鱼胚胎具有敏感、快速、体外测试、高通量且伦理争议少等优点逐渐取代成鱼(或幼鱼)，在环境监测领域中被广泛应用。发光菌毒性测试方法由于灵敏、价格低可以用于污染土壤浸提液生态毒性的快速筛选[23]。目前国内常用的3 种发光细菌为：明亮发光杆菌(Photosbacteriumphosphoreum)、费氏弧菌(Vibriofischeri)和青海弧菌(Vibrioqinghaiensis)。国外的发光菌毒理学研究开展得较早，成套方法一般称为Microtox检验，也有特殊的专为土壤样品而设计Microtox-STP®(固相测试)程序[24]。大型蚤(Daphniamagna)毒性试验在土壤污染测试中，研究的指标主要有死亡率、繁殖率和运动抑制率，其中繁殖率和运动抑制率对重金属污染土壤的浸提液表现出较高的敏感性[25-26]。另外，利用敏感的水生植物对水体污染情况进行监测，也是有效反映水环境生态毒性的重要手段之一。

通过孔隙水吸收是水生生物对污染物的重要暴露途径[27]，对土壤浸出液进行水生生物测定能够分析化学品的迁移的可能性以及其对不同营养等级非目标生物的不利影响[28]。但是受试物种对浸提液pH有严格要求，如斑马鱼胚胎急性毒性测试要求pH在6.8～8.4，发光菌Microtox方法要求pH在6～8等。

表2 水生生物毒性测试方法Tab.2 Aquatic biological toxicity test methods

3 生物毒性测试方法选择

生物毒性测试方法能检测有关污染化学品的信息以及可能危害环境的物质的生物可利用性。但是毒性测试方法对不同污染类型的场地土壤敏感性各异，仅利用单一的毒性测试方法无法准确而全面地反映污染场地的生态毒性效应，成组的生物毒性测试方法可更加准确地揭示土壤的生态毒性。污染场地土壤通常是复杂的混合物，通过使用一系列包含不同功能水平、暴露途径和测试终点的一组测试物种，可以正确评估其毒性，基本要求是有效性(污染场地条件的相关性)和生物测定的灵敏度[27]。生物毒性测试的条件和受试物种可借鉴国际上的标准方法。考虑到场地土壤污染物的复杂性和现场环境条件的多变性，标准方法不可能适用于所有地区，受试物种、试验方法、时间等需根据实际情况进行适当调整。如在选择受试生物时，既要考虑国际上公认的模式生物，同时也应该结合当地的动植物的实际情况，选择更为常见、重要且敏感性好的物种。苗秀莲等人[33]探究了我国5个优势跳虫物种在琼脂培养基条件下对镍(Ni2+)的毒性响应。Santorufo等人[4]利用弹尾虫物种(O.pseudostachianus)作为受试生物，研究其对土壤毒性评估的作用。相比于标准物种跳虫(F.candida)，该物种是欧洲本土物种，且广泛分布于意大利，对当地环境更具有代表性。

孙铁珩等人[34]指出土壤生态毒理诊断的方法体系应建立在土壤的不同功能和特殊用途的基础上。国际标准化组织(ISO)17616中也提到在诊断不同类型的土壤(如农业土壤与自然栖息地)毒性时，要选择不同的生物毒性测试方法[35]。2018年6月我国颁布了农用地(GB15618-2018)和建设用地(GB36600-2018)土壤环境质量标准[36-37]。针对农用土壤而言，建议结合高等植物、动物、微生物毒性测试来综合评价土壤质量；而对于建设用地，建议重点对动物毒性进行测定，而植物和微生物毒性可选择性测定。污染物通过地表径流、淋溶等途径进入到地表水和地下水中，从而引起地表水体和地下水体污染，土壤污染被认为是对附近水生生态系统的主要威胁[38]。因此针对污染场地的生物毒性测试一般应将陆生与水生生态毒性相结合。无论是农用土壤还是建设用地，水生生物毒性测试都是必不可少的。

在众多的生物学指标中挑选出快速、敏感的测试终点来评估场地土壤污染物的生态毒性一直是领域内专家的重点研究方向。除了灵敏性之外，目前人们越来越关注“生物指标的早期预警性”，希望通过“组学”手段来发展新型的生物标志物。另有研究发现存在一些特异性生物标志物能够指示某种特定类型的污染。如金属硫蛋白(Metallothionein)参与调节痕量金属的代谢并防止重金属毒性和氧化应激[39]。在过去几年中，已经提出使用金属硫蛋白作为环境金属污染的生物标志物，使用包括脊椎动物和无脊椎动物在内的不同生物[40-41]。