基于气相色谱质谱的脂肪萎缩小鼠血浆代谢组学研究

吴琪 吴雅韵 韦世杰 余玉英

摘要目的：脂肪萎缩是引起糖脂代谢紊乱的重要因素之一。通过气相色谱质谱联用（GCMS）技术分析aP2nSREBP1c脂肪萎缩小鼠血浆代谢谱的变化，研究与其密切相关的差异代谢物与代谢通路，探讨其生物学基础。方法：应用GCMS技术对6只同窝野生型小鼠和6只转基因小鼠血浆样品进行检测，对检测结果进行多元统计分析，筛选出显著差异的代谢物，借助MetaboAnalyst分析代谢通路。结果：与野生型（wildtype，WT）小鼠比较，转基因（transgenic，TG）小鼠血浆中乳酸、L缬氨酸、3羟基丁酸、尿素、d半乳糖、D阿洛糖、硬脂酸、棕榈酸、肌醇、油酸、11十八碳烯酸含量增加。代谢通路富集分析发现3条脂肪萎缩相关通路。结论：通过对aP2nSREBP1c小鼠血浆代谢组学分析，发现缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，丙酮酸代谢，磷酸肌醇代谢途径与脂肪萎缩相关，为阐明糖脂代谢性疾病的发病机制提供了代谢组学依据。

关键词脂肪萎缩;气相色谱质谱联用;代谢组学

中图分类号：R917文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.009

脂肪萎缩是一种异质性、遗传性或获得性疾病，主要特征是身体脂肪的选择性丧失[1]。过量的脂肪累积或组织萎缩导致脂肪对脂质的储存能力不足，引起外周组织脂毒性损伤和低度炎性反应，增加糖尿病和动脉粥样硬化等糖脂代谢性疾病风险[2]。近年来国内外已有相关文献应用代谢组学技术对肥胖症进行研究，发现了许多与肥胖相关的代谢标志物[35]，但是在脂肪萎缩的代谢组学方面的研究是缺乏的。事实上，脂肪萎缩的遗传突变表型在代谢综合征中并不罕见;脂肪萎缩与肥胖可同时发生，其代谢后果相似可能叠加[67]。因此，研究脂肪萎缩下小分子代謝物的变化有利于更加全面认识糖脂代谢性疾病的发病机制，并在此基础上研发防治策略和药物。

近年来，代谢组学的快速发展为生命科学的研究提供许多便捷，它能定量检测生物体在病理生理刺激或遗传环境因素改变下所产生的动态变化，对于明晰机体发生的代谢变化指出方向。目前，多种分析技术应用于代谢组学研究，而GCMS的应用较为广泛，其特点包括较高检测灵敏度和可供参考的标准谱图库，能够定性分析代谢产物[8]。aP2nSREBP1c转基因小鼠具有白色脂肪少，棕色脂肪肥大的特点。随年龄增加，肝脏脂肪异位沉积逐渐加重，并且伴有严重的胰岛素抵抗问题[9]。由于糖脂代谢紊乱和脂肪生成分化障碍，该小鼠曾用作先天遗传引起的脂肪萎缩症或糖尿病研究[1011]。本实验主要借助GCMS仪器对aP2nSREBP1c转基因小鼠的血浆样品进行代谢组学检测与分析，旨在探究脂肪萎缩条件下血浆代谢物的变化，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物aP2nSREBP1c转基因小鼠由美国Jackson实验室引进，委托南京大学模式动物研究所净化，动物合格证编号：J003393 SCXK（苏）20100001。动物实验期间均饲养于广东药科大学实验动物中心。饲养繁殖条件：SPF级动物房，温度20～25 ℃，湿度40%～70%，12 h：12 h昼夜间断照明，进食普通饲料，自由饮食饮水。

1.1.2试剂与仪器涡旋混合器（德国IKA公司）;台式高速冷冻离心机（美国SCILOGEX公司）;DK8D电热恒温水槽（上海一恒科学仪器有限公司）;HGC24A型氮吹浓缩仪（天津市恒奥科技发展有限公司）;Agilent 7890B/5977B型气相色谱质谱联用仪（美国Agilent公司）。甲醇（色谱纯，德国Merck公司）;甲氧胺盐酸盐（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，F1601013）;吡啶（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）;N，O双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（含三甲基氯硅烷）（87VMHMM，东京化成工业株式会社）;正庚烷（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）;超纯水。

1.2方法

1.2.1动物分组aP2nSREBP1c转基因小鼠是C57BL/6J和SJL背景的杂合子个体，参照Jackson实验室基因型鉴定方法鉴定转基因型和野生型，根据基因型把小鼠分为WT组和TG组。

1.2.2检测指标与方法

1）脂肪组织形态观察：经乙醚麻醉侧眼底静脉丛取血后处死小鼠，迅速分离脂肪组织，置于4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，切片，HE染色，进行病理形态观察分析。

2）血浆样品获取与前处理：10周龄小鼠12 h禁食后经乙醚麻醉，侧眼底静脉丛取血，肝素钠抗凝，离心（3 000 r/min，4 ℃，15 min）取血浆。吸取50 μL新鲜血浆于离心管中，加入200 μL甲醇沉淀蛋白质，涡旋混匀1 min，离心10 min（15 000 r/min，4 ℃），取上清液200 μL氮气吹干。加入20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL，混匀，在70 ℃下肟化1 h。加入50 μL BSTFA（含1%TMCS），在70 ℃水浴下衍生化1 h。加入50 μL正庚烷，涡旋混匀后离心移取上清至微量进样管，待GCMS分析。

3）测定条件：色谱柱：HP5MS（60 m×250 μm×0.25 μm）;进样量：1 μL;进样口温度：260 ℃;进样模式：不分流进样。升温程序：起始温度60 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至100 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升至170 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至210 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至350 ℃保持3 min。电离方式：EI;电子轰击能量：70eV;离子源温度：230 ℃;四级杆温度：150 ℃;溶剂延迟：11 min。

4）数据处理及差异代谢物筛选：使用GCMS联用仪对血浆样品进行检测分析，经过积分后利用美国国家标准与技术局化学数据库（NIST）进行化合物比对。将比对后的数据导入MetaboAnalyst（https：//www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/）在线分析网站，采用无监督模式识别的主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）观察各组分分离趋势，根据倍数变化>1.5和P<0.05筛选差异代谢物[12]，以匹配分数大于80的鉴定结果作为可信结果。

1.3统计学方法采用SPSS软件对样本进行统计分析，2组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。采用MetaboAnalyst进行代谢通路富集分析，鉴别出2组间差异显著的代谢通路。

2结果

2.1表型评价白色脂肪病理切片观察HE染色中，细胞质的脂肪被溶解呈空泡状，细胞核位于细胞一侧。与野生型（WT）小鼠比较aP2nSREBP1c转基因（TG）小鼠白色脂肪细胞内脂滴较少且体积较小。TG小鼠白色脂肪呈萎缩状态。见图1。

2.2血浆非靶向代谢组学TIC图采用GCMS技术对小鼠血浆进行分析，得到血浆代谢物的总离子流图，从中得到样品的化合物信息，质谱信息，离子丰度等。结果显示2组样本多数代谢物的出峰时间集中在12～37 min，但在峰信号和峰数目上存在差别，TG组的峰信号明显强于WT组，表明2组的血浆代谢轮廓存在一定差异。见图2。

2.3主成分分析（PCA）PCA分析是一种无监督模式识别的多元变量统计分析方法，可以通过降维的方式，反映出高维数据样本之间的差异。结果如图3所示，PCA得分图上WT与TG样本点分散于不同区域，说明正常WT小鼠与TG小鼠血浆内源性代谢物具有差异。

2.4差异代谢物的筛选结果本研究共筛选出11种差异代谢产物，与WT比较，TG组中乳酸、L缬氨酸、3羟基丁酸、尿素、d半乳糖、D阿洛糖、硬脂酸、棕榈酸、肌醇、油酸、11十八碳烯酸含量增加。见表1、图4。

2.5代谢产物通路分析将11种差异代谢物导入MetaboAnalyst进行在线数据处理分析。图中每个圆圈对应相关的通路，圆圈的着色代表代谢物在数據中具有不同程度的显著性，着色越深，差异越大;反之，差异越小。根据通路影响值（pathway impact>0.1）得到：缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，丙酮酸代谢，磷酸肌醇代谢，共3条与脂肪萎缩相关的代谢通路。见图5。

3讨论

实验以aP2nSREBP1c转基因小鼠作为研究对象，应用GCMS技术对血浆样本进行代谢组学研究，共筛选出11个差异代谢物（包括氨基酸、脂肪酸、糖）。这些代谢物在脂肪萎缩小鼠血浆中显著上调，表明小鼠体内发生了代谢紊乱。通路富集表明差异代谢物在体内主要涉及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，丙酮酸代谢，磷酸肌醇代谢途径。

缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成属于支链氨基酸（Branched Chain Amino Acids，BCAA）的生物合成途径。BCAA是一种特殊的必需氨基酸。研究认为，BCAA能够激活雷帕霉素（the Mammalian Target of Rapamycinm，mTOR）靶点引起胰岛素抵抗[1314]。机体中BCAA缺乏时，白色脂肪内硬脂酰辅酶a、脂肪酸合酶均被抑制，棕色脂肪组织内解耦联蛋白1表达水平增加，产热耗能增强，脂肪含量快速减少，机体呈现消耗表型[1516]。此外，BCAA被证明可以通过mTOR信号在下丘脑的水平上调节脂肪的瘦素分泌和食物摄入[17]。本研究中缬氨酸在转基因小鼠中的血浆代谢水平显著升高，这可能与小鼠脂肪因子信号通路受损相关[18]。

肌醇参与了磷酸肌醇的代谢途径。肌醇是许多二级信使的前体分子，由葡萄糖合成，是磷脂酰肌醇的组成部分。在胰岛素发挥作用的过程中，磷脂酰肌醇是重要的递质，参与多种信号的传递。乳酸参与丙酮酸代谢途径。丙酮酸作为物质代谢的重要中间体，可通过三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸的相互转化，是三大营养物质代谢联系的枢纽。与酮体代谢相关的3羟基丁酸，与脂肪酸代谢相关的硬脂酸、油酸、棕榈酸、11十八碳烯酸，与糖代谢相关的d半乳糖、D阿洛糖、与蛋白质代谢相关的尿素，血浆代谢水平升高。提示脂肪萎缩可能导致机体的糖脂代谢紊乱，能量代谢异常问题。

脂肪组织不仅是能量储备器官，它还是一个具有多种内分泌、自分泌和旁分泌功能的内分泌器官，脂肪组织通过分泌多种激素及信号调节分子，与胰腺、肝脏、中枢神经系统、免疫系统等进行器官对话[19]。过量的脂肪累积或组织萎缩都将影响全身的代谢。本研究使用的代谢组学技术有助于系统了解机体总的病理生理过程，契合中医学“整体观念，辨证论治”理论。通过该技术分析脂肪萎缩小鼠的差异代谢物变化及其代谢途径，能一定程度上反映脂肪萎缩小鼠代谢水平变化，将为阐明糖脂代谢性疾病的发病机制，研发该病中医药/中西医结合防治策略和创新药物，提供代谢组学的实验依据。

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（2018-12-10收稿责任编辑：王杨）