响应面试验优化饱和水溶液法制备紫苏精油β-环糊精包合物工艺及其理化性质

方浩标　李春海　张钟　张玲　熊岑　彭地纬　谢亚水　徐井水

摘要：建立饱和水溶液法制备紫苏精油β-环糊精（β-CD）包合物的最佳工艺，通过单因素实验，考察β-CD与紫苏精油的比值、温度、时间、超声时间对紫苏精油包埋率的影响，采用Box-Behnken实验设计和响应面分析优化紫苏精油微胶囊的包埋工艺。结果显示最佳的包合条件为：β-CD与紫苏精油比值7：1（g/g）、温度53°C、时间100min，在此最佳工艺条件下，紫苏精油β-CD包合物的包埋率约73%。红外光谱、扫描电镜和热重分析证实了紫苏精油β-CD包合物的形成，为其作为天然抗菌剂和防腐剂应用于食品活性包装领域提供理论基础。关键词：紫苏精油;β-CD包合物;Box-Behnken响应面设计;理化性质

中图分类号：TB48

文献标识码：A

文章编号：1400（2019）01-0047-08

Response Surface Optimization of Preparation of Perilla Oil-Β-Cyclodextrin Inclusion Compound Using Saturated Water Solution Method， And Its Physico- Chemical Properties

FANG Hao-biao， LI Chun-hai， ZHANG Zhong， ZHANG Ling， XIONG Cen， PENG Di-wei， XIE Ya-shui， XU Jing-shui

Abstract： To prepare the β-cyclodextrin （β-CD） inclusion of Perilla oil with a saturated aqueous solution， single factor experiments were used to examine the influence of proportions of wall-to-core ratio， stirring temperature， inclusion time on microencapsulation efficiency. The selected key parameters were optimized using response surface methodology with Box-Behnken experimental design. The results showed that the optimal process parameters were as follows： wall-to-core ratio of 7：1， stirring temperature of 53 °C， inclusion time of 100 min. Under these conditions， the microencapsulation efficiency was approximately 73%. The successful formation of microcapsules of Perilla oil in β-CD was confirmed by Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）， scanning electron microscope （SEM） and thermo- gravimetric analysis （TGA）. Therefore， it provided a theoretical basis application in food active packaging of Perilla oil.

Keywords： Perilla oil; β-CD inclusion compound; Box-Behnken response surface design; physicochemical properties

紫苏精油（Perillaoil）多是从紫苏的叶子和籽中提取的一种挥发性活性精油，具有多种功能如抗氧化、抗菌、抗病毒、杀虫的功效等[1-3]。紫苏精油作为天然抗氧化剂现已成为国内外科研领域的研究热点，广泛用于食品工业、医药、包装材料等工业原料的供应，具有重大的科研价值[4-6]。然而，紫苏精油也存在较多不足，如强挥发性、光敏感性、易降解性且极易被氧化性，在生产与运输过程中易发生损失，这些限制了其在食品包装、农业及其它领域的应用[7-8]。为此，利用包合物缓释技术，形成有效的调控释放系统，提高精油的稳定性[9-10]。

β-环糊精（Cycolodextrin，β-CD）常用的壁材物质，与精油分子形成包合物[11]，这是因为以下几方面原因;首先，β-CD空腔是疏水的，精油分子的非极性越高，越易被其它包合;其次，当疏水亲脂的精油分子进入β-CD空腔后，其疏水基团与β-CD空腔接触最大，然而其亲水基团却远离空腔;另外，β-CD孔径大小不同，能分别选择容纳体积大小与其空腔相匹配的精油分子，这样形成的包合物较稳定[12-13]。本研究拟采用饱和水溶液法制备紫苏精油β-CD包合物，并进行一系列单因素实验和响应面实验来优化包合工藝，实现有效延缓紫苏精油的挥发、延长精油的缓释效果。因此，紫苏精油包合物可以作为抗菌剂和防腐剂应用于生物基可降解活性食品包装领域中。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫苏精油，天津百世化工有限公司;β-环糊精（β-CD，壁材），河南双腾实业有限公司;无水乙醇（分析纯），天津市百世化工有限公司，等。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计，上海仪电科学仪器股份有限公司;傅里叶红外光谱仪（FTIR），美国电热公司;扫描电子显微镜（SEM），日本电子株式会社;超声波清洗器，德国Elma公司;TGAI型热重分析仪，瑞士梅特勒公司，等。

1.3 实验方法

1.3.1 紫苏精油β-CD微胶囊的制备

参考林玉环等[14]适当修改后，采用饱和水溶液法来制备紫苏精油β-CD包合物。称取适量β-CD倒入烧杯内，加入一定量的蒸馏水，在恒温油浴锅中搅拌溶解至溶液由乳白色刚好变为澄清为止，为β-CD的饱和溶液。取1g的紫苏精油，在一定温度条件下，将其逐滴加入到饱和溶液中，待出现浑浊且有白色沉淀出现时，继续搅拌至规定时间，停止加热，继续搅拌至室温。将其放置在4°C冰箱冷藏24h，待β-CD包合物充分析出，抽滤，滤渣用蒸馏水和无水乙醇分别洗涤3次，洗去吸附在β-CD空腔外部的紫苏精油和未包埋的β-CD，然后于50°C真空干燥箱至恒重，得紫苏精油β-CD包合物。

1.3.2 包合物的效果评价

1.3.2.1 紫苏精油的标准曲线制作[15]

精确称取10mg紫苏精油标准品，于100mL容量瓶中用无水乙醇溶解，稀释适当倍数，以无水乙醇为空白，在200～400nm波长范围扫描，确定最大吸收波长204nm处。精确量取一定紫苏精油标准液，用无水乙醇稀释为质量浓度分别为1、3、5、7、9μg/mL的标准溶液，于204nm波长处测定吸光度，并以吸光度为纵坐标（Y）、紫苏精油标准溶液质量浓度为横坐标（X），得到标准曲线为y=4.62x+0.1314，R2=0.9978（n=5）。

1.3.2.2 紫苏精油含量测定

精确称取20mg包合物品于洁净干燥的称量纸上，将其转移至50mL的容量瓶内，用无水乙醇定容至刻度线，摇匀，通过预实验发现制得的包合物产品于超声45min，紫苏精油的浸出效果最佳。将50mL容量瓶超声45min。震荡结束后摇匀，从容量瓶内取适量的混合液于离心管内，在3500r/min和25°C下高速离心15min。倒出适量上清液并测出其在最大吸收波长（204nm）下的吸光值。最后根据绘制出的标准曲线，计算包合物中紫苏精油的含量。

1.3.3 单因素实验与因素水平选择

（1）壁芯比对包埋效果的影响，固定包合温度为60°C、搅拌时间为1h，设置芯壁材比分别为4：1、6：1、8：1、10：1、12：1，考察不同壁芯比对包合物包埋率的影响。

（2）温度对包埋效果的影响，固定壁芯比为8：1、搅拌时间为1.5h，设置包合温度分别为40、50、60、70、80°C，考察不同温度对包合物包埋率的影响。

（3）搅拌时间对包埋效果的影响，固定壁芯比为8：1、包合温度为60°C，设置搅拌时间分别为30、60、90、120、150min，考察不同搅拌时间对包合物包埋率的影响。

1.3.4 响应面试验

在单因素实验基础上，采用Design-ExpertV8.06软件，根据Box-Behnken实验设计原理，选择对包合物包埋率影响显著的壁芯比（A）、包合温度

（C）、包合时间（B）为自变量，以包埋率为响应值，筛选紫苏精油β-CD包合物最佳工艺参数，实验因素与水平设计见表1。

1.3.5 表征方法

制备样品的理化性质表征采用扫描电镜、傅里叶红外光谱仪、激光粒度分析仪和热重分析仪对其进行表征。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 芯壁材比对包埋效果的影响

考察因素如壁芯比、包合温度和包合时间对β-CD紫苏精油包合物包合率的影响，结果如图1所示。

由图1可知，饱和水溶液法制备紫苏精油β-CD包容物单因素分析结果显示，β-CD与紫苏精油质量比8：1;包合温度应控制在60°C;包合时间为90min左右最佳。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计与结果

基于单因素试验结果，选择对包埋率影响显著的壁芯比（A）、包合时间（B）、包合温度（C）为自变量，以包埋率为响应值，设计了三因素三水平响应面分析试验，试验方案及结果见表2，采用Design-ExpertV8.06软件对试验数据进行二次响应面回归分析，得到的包合物包埋率与各因变量的模拟方程为：

Y=72.54-139·A+0.23·B-2.85·C+0.72·A·B+1.48·A·C+0.53·B·C-2.31·A2-2.15·B2-2.65·C2。

2.2.2 响应面方差分析结果

方差分析见表3，该模型的P<0.01，说明该二次方程模型为极显著。决定系数为R2=0.9152，说明该回归模型的拟合情况较好，回归方程代表性较好，其响应值的变化有91.52%来自于所选的变量;模型调整系数（RAdj2）为0.8061，表明该回归模型的拟合情况良好，实际值与预测值较为接近;模型精密度为7.919，>4，说明该模型是可行的，其可靠性可通过方差分析及相关系数来考察[16]。从回归方程各项的方差分析结果还可看出方程的失拟项P值为0.0913，不显著，表明该方程对试验拟合程度好、误差小，可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析和预测，因此将该模型适于饱和水溶液法制备紫苏精油β-CD包合物工艺参数优化。

由表3中F值的大小可判断各因素对包合物包埋率影响的强弱，F值越大，对包埋率影响作用越强[17]。各个因素对紫苏精油β-CD包合物包埋率的影响程度大小的次序为包合温度（C）>壁芯比（A）>包合时间（B）。其中C、C2对包埋率的影響极显著（P<0.01）;A、A2、B2对包埋率的影响显著（P<0.05）。

2.2.3 响应面分析

紫苏精油β-CD包合物包合响应面（图4）可直观的反映出，壁芯比和包合温度对包合物包埋率的影响显著。在包合温度和包合时间不变的条件下，随着壁芯比的增加，包埋率先上升后趋向平缓。在壁芯比和包合时间不变的情况下，包埋率先随着包合温度的增大而升高，达60°C后包埋率升高不显著。当壁芯比和包合温度不变时，随着包合时间的增加，包埋率先升高后下降，90min达最大值。根据等高线图可知，壁芯比和包合温度的等高线呈椭圆形，说明两者交互作用显著;壁芯比和包合时间、包合温度和包合时间的等高线图接近圆形，说明其交互作用均不显著。

通过回归模型预测的包合物包合制备最优条件：β-CD：紫苏精油比值为6.75：1，包合温度52.98°C，包合时间99.07min，包埋率预测值为73.49%。为了便于操作最优条件修正为β-CD：紫苏精油比值为7：1，包合温度53°C，包合时间100min，在此条件下。在此条件下做6组验证实验，β-CD对紫苏精油的包埋率达73.24%±0.50，与预测值相差不大，标准差为0.34%，模型真实可靠。

2.3 理化表征

2.3.1 表观形貌分析

采用扫描电镜对β-CD和最佳水平下制得的包合物的表面形貌进行扫描，扫描如图3。

由图3可见，β-CD外形为斜菱形，颗粒大小不均且分布散乱，表面没有破裂，也没有明显的折皱;然而，由β-CD与紫苏精油形成的包合物晶体的SEM图可见，包合物颗粒大小趋于均匀，聚集性更强，表面开始出现了皱褶和凹痕，这使得它与混溶体系中的其他物质分子进行碰撞时，能够产生一定的包埋作用。对比图3（a-b）形貌变化，预示着紫苏精油已被β-CD包埋。

2.3.2 FTIR分析

紫苏精油、β-CD及它们的包合物FTIR结果如图4所示。

从图4（a）和图4（c）可知，紫苏精油原本在3010cm-1，1747cm-1和1463cm-1的特征吸收峰在包合物中出现位移，且2855cm-1，1747cm-1处的峰值强度减弱。然而，图4（b）和图4（c）中，在3387cm-1，1417cm-1，1154cm-1，1031cm-1包合物和β-CD均有吸收峰，峰形相同;但两者之间的吸收峰也存在差异，1640cm-1出吸收峰发生了位移。结果显示：紫苏精油-β-CD包合物成功合成。

2.3.3 粒径分析

使用激光粒度分析仪对优选制备的紫苏精油-β-CD包合物进行粒径分析，结果如图5。

由图5可以看出紫苏精油-β-CD包合物的粒径呈现一种正态分布，粒径分布主要集中在80～90μm，平均粒径约为86μm，这与SEM图片中的尺寸基本相符。

2.3.4 TG分析

热重分析仪对β-CD和制备得到的紫苏精油包合物进行热重分析，TG曲线见图6所示。

由图6（a）可知，β-CD有两个失重阶段，β-CD第一阶段是从30°C到终止温度111°C，失重率为12.56%，此阶段为自由水的蒸发阶段;第二阶段是从313°C到终止温度346°C，失重率达到61.54%。图6（b）可见，包合物的失重同样分为两个阶段，分别为30～107°C和306～335°C，失重率分别为11.13%和47.68%。包合物在第一阶段的失水程度略微弱于β-CD，因为β-CD与紫苏精油的疏水相互作用使得β-CD内腔失去了部分结晶水。第二阶段为壁材热分解阶段，失去壁材的保护后，紫苏精油也在此阶段开始挥发损失。结果显示：包合作用提高了紫苏精油的热稳定性。

3 结论

本实验選用β-CD与紫苏精油为原料，采用Box-Behnken实验设计和响应面分析优化紫苏精油-β-CD包合物微胶囊的包埋工艺。结果显示：最佳的包合条件为：β-CD与紫苏精油比值7：1（g/g）、温度53°C、时间100min，在最佳工艺条件下，紫苏精油β-CD包合物的包埋率约73%，FTIR证实紫苏精油被成功包合在β-CD中。包合物的粒径分布集中在80～90μm;SEM显示包合物趋于均匀，表面开始出现了皱褶和凹痕;TG结果表明β-CD与紫苏精油的相互作用使得体系的热稳定性提高，降低了紫苏精油的挥发损失。如此，为紫苏精油-β-CD包合物作为天然抗氧化剂应用于食品活性包装领域提供理论依据。

参考文献：

[1]薛山.紫苏精油的研究新趋势[J].中国食品添加剂，2011，01：199～204.

[2] Scapin G， R.Abaide E， F.Martins R. Quality of perilla oil （Perilla frutescens） extracted with compressed CO2 and LPG [J]. J Super Fluid， 2017， 130：176～182.

[3] Yu H， Qiu JF， Ma LJ， et al. Phytochemical and phytopharmacological review of Perilla frutescens L. （Labiatae）， a traditional edible-medicinal herb in China [J]. Food and Chemical Toxicology， 2017， 108：375～391.

[4]邵平，洪台，何晋浙，等.紫苏精油主要成分季节性变化分析及其干燥方法研究[J].中国食品学报，2012，9：216～221.

[5] Ide T， Tanaka A. α-Lipoic acid ameliorated oxidative stress induced by perilla oil， but the combination of these dietary factors was ineffective to cause marked deceases in serum lipid levels in rats [J]. Nutrition Research， 2017， 48：49～64.

[6]王素君，张良晓，李培武，等.紫苏籽油抗菌活性研究

[J].中国食品与营养，2017，23（11）：38～42.[7]王建，薛山，赵国华，等.紫苏不同部位精油成分及体外抗氧化能力的比较研究[J].食品科学，2013，7：86～91.

[8] Li HZ， Zhang ZJ， Hou TY， et al. Optimization of ultrasound-assisted hexane extraction of perilla oil using response surface methodology [J]. Industrial Crops and Products， 2015， （76）：18～24.

[9]王素君，张良晓，李培武，等.紫苏籽油抗菌活性研究[J].中国食物与营养，2017，23（11）：38～41.

[10] Rodrigues LB， Brito AO， Martins PB， et al. Anti- inflammatory activity of the essential oil obtained from Ocimum basilicum complexed with β-cyclodextrin （β- CD） in mice [J]. Food and Chemical Toxicology， 2017， 109： 836～846.

[11]童林荟.环糊精化学[M].北京：科学出版社，2001，p10～11.

[12]张雯文，马建武，任和，等.环糊精包合技術及在食品工业中的应用进展[J].食品工业，2014，35（09）：256～260.

[13]RenXL， YueSL， XiangH， XieMC.Inclusioncomplexesofeucalyptusessentialoilwithβ-cyclodextrin： preparation， characterizationandcontrolledrelease[J].J.PorousMater， 2018， 25：1577～1586.

[14]林玉环，高昆，况鹏群，等.金银花精油及其与β-环糊精包合物的制备工艺研究[J].安徽农业科学，2017，45（05）：67～69.[15]廖霞，杨小兰，李瑶，等.响应面试验优化复凝聚发制备槲皮素微胶囊工艺及其理化性质[J].食品科学，2016，37（22）：20～28.

[16]韩爱芝，蒋卉，贾清华，等.响应面实验优化黑果枸杞花生苷微胶囊制备工艺及其稳定性分析[J].食品科学，2016，37（10）：82～86.

[17]徐蓉蓉，高垚垚，周云龙，等.薏苡仁油β-环糊精包合物的制备及其表征[J].食品工艺科技，2017，12：258～263.