甘蓝冷胁迫相关基因BobHLH18克隆与表达分析

秦文斌 戴忠良 山溪 唐君 王神云 李建斌

冷胁迫是影响作物生长、发育和产量的重要非生物胁迫因子之一。已有研究者指出，转录因子作为转录调控的关键节点在植物应答冷胁迫过程中起重要作用。转录因子在结构上通常具有DNA结合结构域、转录调控域及核定位信号区等功能域，其中DNA结合结构域决定着转录因子与顺式作用元件结合的特异性，使其发挥转录调控功能。bHLH转录因子作为一类重要的植物逆境相关转录因子蛋白，因其在结构上含有1个由10-15个氨基酸的氨基酸-基本区和40个氨基酸左右的α-螺旋环α-螺旋区（HIM区）构成的50-60个氨基酸组成的bHLH保守结构域而得名。其中，基本区域位于bHLH结构域的N-端，具有DNA识别和结合顺式元件的功能。近年来随着多个植物基因组的测序完成，大量的bHLH转录因子家族成员已被鉴定，在拟南芥和水稻中bHLH转录因子家族分別有超过140个和160个成员，而在烟草、二柄短麦草、白菜和番茄中则分别含有190、146、230和159个bHLH成员。

甘蓝（Brassica oleracea var.capitata L.）是中国一种重要的芸薹属蔬菜，全国各地均有栽培。随着近年来甘蓝种植区的扩大，尤其露地越冬甘蓝品种的大面积推广，生产上对耐低温的品种需求逐渐提高。而目前对甘蓝耐寒材料筛选多依赖于田间自然低温条件下的人工筛选，易受环境干扰，选择效率不高，因而开展耐寒基因鉴定及利用与耐寒基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，是提高甘蓝耐寒育种效率的重要手段。目前，在模式植物拟南芥上已有多个与耐寒性相关的基因被鉴定，如bHLH类的ICEl基因、AP2/DREB类的CBFl/CBF2/CBF3基因、COR基因、bZIP类RISBZ5、HOSl基因等。且已有研究结果表明，拟南芥bHLH转录因子具有广泛的生物学功能，如调节种子萌发，表皮细胞形成，心皮发育，花药发育，果实开裂，黄酮类及花青素生物合成及响应光敏色素，激素信号，胁迫诱导等过程。

甘蓝Y923为重组自交系，具有耐寒，抽薹迟等特性，目前该材料已进行了三代基因组测序，以其为研究对象鉴定耐寒相关基因，能为后续整合其基因组信息解析甘蓝耐寒机制奠定前期基础。为探讨bHLH转录因子在甘蓝耐寒方面的功能，本研究利用同源克隆方法，设计甘蓝类bHLH转录因子基因的特异扩增引物，结合RT-PCR技术在甘蓝Y923冷处理全长cDNA文库中，获得一个受冷胁迫诱导表达的bHLH转录因子基因，并根据其与拟南芥bHLH基因的同源性，将其命名为BobHLHl8。本研究对该基因在甘蓝中的序列特征、基因结构、染色体定位及其在冷胁迫下的时空表达模式进行了分析，为进一步研究该基因功能提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

用于转录因子克隆的甘蓝冷胁迫全长cDNA文库由本实验室构建。基因序列克隆和冷胁迫处理所用的甘蓝材料为结球甘蓝（Brassica oleracea var.cap-itata）自交系Y923。选“四叶一心”期用1/2MS培养液在培养室水培7 d的甘蓝幼苗，转入4℃的低温光照培养箱中进行冷胁迫处理，以培养室正常生长的植株为对照，分别在Oh、6 h、12 h、24 h和48 h时收集处理甘蓝和对照植株的根、茎、叶，液氮速冻，-80℃保存备用。

1.2 BobHLHl8基因全长序列的克隆

以T1和T2（表1）为引物，对筛选到的bHLHl8全长eDNA克隆进行双向测序，通过DNAMAN软件对序列进行拼接组装，得到一致序列后提交NCBI进行ORF的预测。根据bHLHl8的eDNA序列设计引物，在甘蓝gDNA中和eDNA中扩增bHLHl8基因，对PCR产物进行胶回收并克隆到pMDl8-T载体上，然后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序验证。

1.3 BobHLHl8基因染色体定位

通过搜索芸薹属基因组数据库Brassica database（BRAD;http：//brassieadb.org/brad/）中与BobHLHl8基因序列完全相同的基因座序列及其基因组位置信息，对BobHLHl8进行电子定位及拷贝数分析。

1.4 BobHLHl8基因序列分析

利用DNAMAN和ORF Finder在线软件进行核苷酸和氨基酸同源序列比对和开放阅读框预测。利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）在线工具对bHLH进行保守域预测。用EXPASy在线工具Prot-Param（http：//www.expasy，org/tools/protparam.html）进行蛋白质的分子量和等电点计算。用PSORT（http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/）在线工具进行蛋白质亚细胞定.位预测。同时，以BobHLHl8蛋白质氨基酸序列作为母序列，在GenBank中搜索其他物种中与该基因同源的序列，并通过MEGA软件进行进化分析。