凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合症病虾与健康虾肠道优势菌群比较分析

蒋葛 沈辉 万夕和 乔毅 黎慧 王李宝 史文军

摘要：为研究急性肝胰腺坏死综合征（Acute hepatopancreatic necrosis syndrome，AHPNs）病原对凡纳滨对虾肠道菌群的影响，获取更多的AHPNs防治基础资料，采用PcR-RFTJP方法比较了江苏地区患AHPNs病虾和健康对虾肠道微生物群落。结果发现，不同生长阶段病虾肠道中均只有弧菌属细菌;对照的健康对虾中，幼虾肠道优势菌为假单胞菌属、食酸菌属和固氮螺菌属细菌;养殖中期对虾肠道优势菌为发光杆菌属、弧菌属和希瓦氏菌属细菌;养殖后期对虾肠道优势菌为弧菌属、红杆菌属、莱茵海默氏菌属细菌。研究结果表明，凡纳滨对虾患AHPNs后肠道微生物群落明显不同于健康对虾，肠道菌群多样性遭到破坏，弧菌为肠道内绝对优势细菌，不同生长阶段健康对虾的肠道优势菌存在差异。本研究探究了AhPNs病原对于凡纳滨对虾肠道菌群的影响，并为认识和防控AHPNs提供试验基础。

关键词：对虾急性肝胰腺坏死综合症：凡纳滨对虾：肠道微生态

中图分类号：s945.1 文献标识码：A 文章编号：1000-4440（2019）01-0142-07

急性肝胰腺壞死综合征（Acute hepatopancreaticnecrosis syndrome，AHPNS）是近年来影响凡纳滨对虾养殖业的一种重要疾病。2009年该病在中国海南省发生，越南、马来西亚、泰国、菲律宾相继暴发该病。2011年以来，AHPNS在中国广东、广西、福建、江苏等对虾主产区蔓延，造成凡纳滨对虾产量锐减：泰国、越南、墨西哥等凡纳滨对虾主产国的对虾产量也因该病的发生而受到严重影响。

凡纳滨对虾发生AHPNS后体色发白，虾壳变软，摄食明显减少，活力减弱，行动迟缓。对虾感染前期肝胰腺颜色暗淡苍白或糜烂发红，异常肥大：感染后期肝胰腺明显萎缩，空肠空胃。苗种感染10d就可发病死亡，发病3 d内死亡率可达100%。有研究结果显示，一类携带有特定致病基因PirA和PirB的弧菌属细菌是该病发生的病原，其中主要是副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus）。病原弧菌含有的PiM和PirB基因会产生一种独特的二元毒素，使靶细胞内外渗透压改变，导致感染对象死亡。Pi-ra和PirB位于一段69 kb大小的隐藏质粒“pVAl”上，该质粒含有转座子基因，能发生水平基因转移，被认为是AHPNS近年来传播较快的主要原因。目前，尚未见AHPNS有效治愈的报道。

肠道菌群在维持对虾健康中发挥着重要作用，对对虾的生长与免疫具有重要影响。对虾肠道菌群不仅可以分泌虾体所需的营养素，而且可通过竞争排斥抵抗病原微生物的侵袭，通过分析肠道菌群，可了解凡纳滨对虾的健康状况。目前相关研究仅限于正常对虾肠道菌群，且仅见于饲料添加剂、微生态制剂对肠道菌群的影响方面，关于特定病原对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响报道较少。本研究通过健康对虾与AHPNS病虾的肠道细菌群落比较，研究AHPNS病虾的肠道菌群结构变化，可以从肠道微生态调控的角度为该病的防控提供基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验对虾3份疑似AHPNS病虾样品（BSl～BS3）来源于江苏省如东市3处出现大规模-对虾暴死的养殖场，表现为肝胰腺萎缩，空肠空胃，濒死症状。对照样品来自相同养殖场同批正常对虾（表1），样品采集后冷藏，24h内带回实验室。每份样品取6只对虾个体，测量体长并计算均值：无菌操作分离对虾肠道，清除内容物，取6只对虾的肠道混合为一个样品，灭菌生理盐水冲洗内表面后置于离心管中，研磨成匀浆，80℃冷冻备用。

1.1.2主要试剂Taq DNA聚合酶、dNTPs、DLl00DNA marker、PMDl9-T克隆试剂盒和限制性内切酶为宝生物工程（大连）有限公司产品。DNA提取试剂盒（3S DNA Isolation Kit V2.2）、DNA胶回收试剂盒为上海博彩生物技术公司产品。

研究发现，AHPNS病虾的肠道菌群结构单一，弧菌属细菌为绝对优势菌。有研究结果表明，白斑综合征病毒（WhKe叩ot syndrome virus，WSSV）仅仅使得肠道菌群中各种属细菌的数目和比例发生了改变，肠道菌群多样性并未发生明显变化，而AHPNS病原菌相较于WSSV，对于对虾肠道菌群的影响更大，其造成肠道菌群结构崩溃，印证了AHPNS引发高死亡率的特点。PiWAB基因编码的二元蛋白毒素可插入感染对象的细胞膜上形成穿模孔洞，导致细胞内外渗透压的改变，使靶细胞损伤甚至死亡。本研究中病虾肠道近乎透明，肠道细窄，韧性消失，无内容物。AHPNS病原菌的毒力极强，进入对虾肠道后，分泌毒素，对虾肠道细胞不断坏死脱落，肠道细菌可能随着坏死的肠黏膜和粪便一起排出体外，病虾肠道菌群结构被完全破坏。肠道菌群对于对虾的生长和抗病具有重要作用，堪称是对虾的另类“器官”，若肠道菌群结构被完全破坏，则对虾的消化和抗病能力受到显著影响。

虾类肠道菌群结构与其所处的生长阶段、生长环境以及健康状况有关。吴金凤等研究发现发病对虾肠道菌群多样性显著降低，孙振丽等通过高通量测序研究发现凡纳滨对虾肠道菌群与池塘底泥及水体菌群关系密切。水生动物通过摄食将环境微生物和藻类摄入肠道，某些细菌被排出体外，部分细菌定殖于肠道。对虾养殖水体以及自然水体中的主要优势菌群为a-变形细菌纲和y-变形细菌纲细菌，凡纳滨对虾肠道菌群的主要优势细菌类群为变形菌门和厚壁菌门细菌，主要包含弧菌属、假单胞菌属、发光杆菌属等细菌。本研究中健康对虾ZCl、ZC2样品为20日龄和50日龄的对虾群体，肠道菌群受水体菌群影响，优势菌为弧菌属、发光杆菌属、红杆菌属细菌，归属于a-变形细菌纲和y-变形细菌纲。对虾肠道菌群的组成是动态变化的，不同生长阶段对虾肠道菌群的组成也有较大的区别。虾卵、糠虾与幼虾阶段的虾体内的优势菌群为红环菌科、柄杆菌目、伯克氏菌目、黄杆菌目、肠杆菌科、假单胞菌科细菌，弧菌属细菌为劣势菌。这与本研究的研究结果相近，ZC3样品为幼虾，肠道中优势菌为假单胞菌属、食酸菌属、短波单胞菌属和固氮螺菌属细菌。在分类地位上，食酸菌属归属于伯克氏菌目，固氮螺菌属归属于红环菌科，短波单胞菌属则归属柄杆菌目。浮霉菌属细菌是肠道优势菌群，吴定心首次发现浮霉菌纲（Planctomycetacia）细菌为凡纳滨对虾肠道菌群优势菌，并认为厌氧氨氧化细菌来自该纲，对氮循环起到一定作用。弧菌属与发光杆菌属是条件致病菌，当凡纳滨对虾受到氨氮等环境因子以及其他病原胁迫时，可能发生继发性感染，发生多种病原毒力叠加。

本研究采用PCR-RFLP法研究了急性肝胰腺坏死综合症对凡纳滨对虾肠道菌群的影响，结果发现，健康凡纳滨对虾肠道优势菌为弧菌属、红杆菌属、莱茵海默氏菌属、发光杆菌属、弧菌属等细菌，而凡纳滨对虾发生AHPNs后肠道菌群结构单一，肠道中弧菌属细菌为绝对优势细菌。