高分辨熔解曲线基因分型技术及其在水稻分子育种中的应用

顾建强

摘 要：高分辨熔解曲线（high-resolution melting， HRM）分型技术是基于不同DNA片段双链熔解温度差异而进行基因分型的技术，理论上可以区分单个碱基差异的不同DNA分子。由于其较高的分辨率及无需传统的凝胶电泳等优点，HRM技术发明后在医学诊断、植物分子育种等方面得到了大量应用。通过分析HRM的技术特点，并总结HRM技术在水稻分子育种中的应用进展，最后展望了HRM技术在水稻分子育种中的发展方向及应用前景。

关键词：高分辨熔解曲线;基因分型;水稻;分子育种

中图分类号：S 511 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2019）10-014

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.10.014

Abstract： High resolution melting was a genotyping technology based on the double-stranded melting temperature differences of different DNA fragments， which could theoretically distinguish different DNA molecules with single base differences. Because of its advantages such as high resolution and the absence of traditional gel electrophoresis， HRM technology has been widely applied in the aspects of medical diagnosis， plant molecular breeding and so on after its invention. By analyzing the technical characteristics of HRM， the application progress of HRM technology in rice molecular breeding was summarized， and then the development direction and application prospect of HRM technology in rice molecular breeding were prospected.

Key words： High resolution melting; Genotyping; Rice; Molecular breeding

高分辨熔解曲線（high-resolution melting， HRM）是一种新型检测突变和基因分型的技术[1]。由于其检测的高效性、高分辨率及较低的成本，HRM技术自提出后在医学和植物科学等领域都得到了广泛的应用[2-3]。水稻是我国重要的粮食作物，也是单子叶模式植物，基因编辑和基因聚合育种等分子育种手段在水稻上得到广泛的应用[4]。基于HRM技术的突变体筛选、全基因组背景标记及功能标记开发等工作对提高水稻分子育种的效率，降低分析成本发挥着重要作用，具有广泛的应用范围和前景。

1 HRM基本原理

DNA片段为双螺旋结构，随着温度升高DNA双链会逐渐解开，结合实时定量PCR技术，可以通过监测荧光信号实时观察DNA双链的熔解程度，根据温度和熔解程度绘制熔解曲线。DNA双螺旋结构一半解链的温度为熔解温度（Tm），Tm值和DNA分子的碱基组成及长度相关，GC含量越高，片段越长，Tm值越高。因此可以通过分析DNA熔解曲线测定Tm值对不同的DNA分子进行区分，实现基因分型。利用熔解曲线实现基因分型的关键在于合适的荧光染料及灵敏的检测设备[5]。荧光染料嵌合在DNA双链中，显示荧光。在熔解曲线的检测过程中，随着温度逐渐升高，DNA双链逐渐解链，荧光染料脱离DNA，成为游离状态，使得荧光信号值逐渐降低。在低温到高温过程中，仪器每间隔一定的温度检测1次荧光信号，最终将采集的荧光信号绘制为熔解曲线。

荧光染料有饱和染料和非饱和染料两种类型。最早的荧光染料为SYBR Green I，是一种非饱和染料，在DNA双链高温解链时，单链部分的染料分子发生迁移，重新结合到DNA尚未解链的双链部分，造成荧光信号强度没有发生变化，不能真实反映DNA双链准确的解链温度。而饱和染料则克服了这类问题，DNA解链时脱落的染料不会再迁移到未解链的部分，荧光信号能真实反映DNA的解链程度。饱和染料有LC Green、LC Green Plus（Idaho）、EvaGreens（Biotum）和LightCycler480 ResoLight Dye （Roche）等多种类型。研究发现，价格较低的EvaGreen使用效果和LC Green效果相当[6]，因此EvaGreen得到了较广泛的应用[2，7-10]。

由于不同DNA分子间的SNP所导致的Tm值差异细微，因此要求荧光检测设备控温准确、精确以及样品孔间一致性好。2000年，Idaho公司推出了首款高分辨熔解曲线分析仪HR1。该仪器每摄氏度能采集40～120个数据点，实现了高精度的熔解曲线分析。但该设备为单通道，无PCR功能，不能满足高通量检测的需求[11]。随后Idaho公司推出了经典的LightScanner。LightScanner有96和384两种通量可以选择，并且检测速度快，5 min即可完成，实现了较高通量的检测。目前市场上多款定量PCR仪如瑞典Roche公司的lightcycle480[12]、QIAGEN公司的Rotor-gene Q[13]和ABI 7500[14]等均有HRM功能。

2 HRM技术和其他分子标记检测技术比较

2.1 高分辨率和高效率

和传统电泳方式相比，HRM无需制胶、点样、电泳、读带等繁琐过程，分析效率高，并且传统电泳包括分辨率较高的聚丙烯酰胺凝胶电泳也难以区分2个碱基以下的DNA片段，而HRM可以区分包括SSR、InDel和SNP在內的各种多态性[15]。

2.2 高稳定性和准确性

和KASP等基于等位基因竞争性扩增方法相比较，扩增过程基本没有假阳性，其检测的准确性的关键取决于扩增产物的特异性、检测设备温度控制的精确度和均一性。随着设备性能的提升，HRM检测的稳定性和准确性会更有优势。

2.3 适用范围广

HRM检测时只需要待测位点两侧的序列即可，待测位点可以是未知的，而等位基因竞争性扩增则必须已知待测位点信息，并且只能检测双等位变异。因此HRM技术有着更广泛的用途，如复等位基因检测[8]，突变位点检测[16-17]等。

3 HRM在水稻分子育种中的应用

基于HRM技术的诸多优点，自该方法提出后在水稻分子育种方面也得到了广泛的应用，包括全基因组背景分子标记开发、功能分子标记开发、诱变突变体鉴定、基因编辑后代鉴定等多个领域都得到了广泛的应用。

3.1 全基因组分子标记开发

金名捺等[10]2018年根据9 k的全基因组芯片对2个水稻品种扫描后获得4198个SNP位点，将其中第12号染色体的部分SNP成功转化为HRM标记并在群体中进行了验证。赵均良等[15]利用HRM技术对SSR、InDel和SNP等不同类型的多态进行了检测，成功分析了1个G和A转换的SNP位点，以及1个聚丙烯酰胺凝胶难以区分的SSR位点和1个InDel位点。上述结果显示了HRM技术在DNA多态检测上的灵敏性及灵活性。灵敏性指能分析SNP，灵活性是指能分析包括SNP、SSR及InDel等多种类型的多态性。

3.2 功能分子标记开发及应用

盛夏冰等[12]针对水稻落粒性基因qSH1调控区的关键SNP碱基G到T的突变，通过优化扩增片段长度、DNA及镁离子浓度等，成功地利用HRM技术实现了基因分型，为水稻落粒性的分子育种奠定了基础。该研究通过比较不同扩增大小的产物发现，小片段（68 bp）更有利于基因分型。罗文龙等[7]采用了巢式扩增水稻直链淀粉含量Wx基因和香味基因fgr功能位点特异性片段，利用HRM技术成功对88份水稻的Wx基因SNP位点及fgr位点的InDel进行了分型，显示了在HRM技术平台的通用性，可以同时对SNP和InDel等不同类型的多态性开展分析。司浩杰等[16]将水稻DNA简易提取方法和HRM技术相结合，对花培后代水稻光敏不育基因PGMS进行了高效检测。平均96个样品取样、DNA提取和检测时间控制在2.5 h。

水稻稻瘟病抗性基因由于存在多个复等位基因及在基因组中存在同源序列，导致抗性功能标记检测繁琐，金名捺等[8]利用HRM成功地利用HRM技术开发了针对Pi2基因的特异性分子标记，并利用该标记检测发现23份水稻不育系均不含Pi2，但能准确跟踪4个Pi2基因改良后代的基因型，显示了HRM基因检测的高效性及准确性。王平等[9]利用HRM技术开发了香味基因fgr，稻瘟病抗性基因Pita及Pik功能标记，并利用这些标记分析了46份水稻三系不育系的基因型。Wang等[17]在粳稻品种koshihikari和籼稻guichao2中鉴定了一个miRNA前体osa-MIR2923a中存在一个G/A多态性，利用HRM技术对两个材料衍生的重组自交系群体进行了多态性检测，发现种子长度和该多态显著相关。Shabanimofrad等[2]为筛选抗稻飞虱基因连锁标记，用HRM技术从110对SSR标记中筛选出57个多态标记，并筛选到2个连锁的SSR标记。将水稻抗飞虱基因连锁的SSR标记用HRM技术进行了检测。

3.3 基因编辑后代等突变体鉴定

TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）技术是一种定向诱导基因组局部突变的技术。Li等[18]利用将HRM技术对水稻伽马射线诱发TILLING突变体库后代进行了高通量的筛选，发现以4株M2植株混合一个池进行检测效果最佳。在4560个M2中，对OsLCT1和SPDT等2个基因筛选到包括G突变A的SNP、单碱基缺失及3碱基缺失等多种类型的突变。传统TILLING后代突变体筛选是基于酶切结合聚丙烯酰胺凝胶电泳的方式，比较耗费时间和精力。HRM技术在TILLING上应用极大地提高了检测效率。类似地，Lochlainn等[19]在白菜的TILLING突变后代中也利用HRM技术。由于基因编辑技术的发展，在水稻等基因组明确、遗传转化体系完善的作物上可以实现基因的定点突变，但对不能遗传转化，基因组信息未充分阐明的作物上，TILLING技术仍然是获得特定基因突变体的重要手段和方式。HRM技术在TILLING上应用极大提高了突变检测的效率[20]。

由于HRM技术的能区分包括SNP和InDel在内的各种类型的多态性，并且无需已知突变信息的特点，非常适合用于基因编辑后代等突变体鉴定筛选工作。姜明君等[21]利用HRM技术分析了TALEN定点突变水稻苯达松抗性基因CYP81A6的后代，从110株T0代转化苗中筛选到3株突变体，和其他基因编辑后代检测方式如酶切、测序等相比较，HRM能以较低的成本完成高效的突变体筛选工作，并且不受突变位点是否存在限制性酶切位点等特征的限制。

4 结论与展望

HRM技术由于其操作简便、通量较高、结果准确可靠、成本低廉等诸多优点越来越受到重视，并得到广泛的应用。而水稻是我国重要的粮食作物，也是植物领域的模式植物。我国近年来在水稻功能基因发掘与鉴定方面取得了重要的突破[22-23]，为水稻的分子育种提供了坚实的基础。由于在实施HRM分析时需要优化扩增片段大小、反应参数等以使得扩增具有较强的特异性，因此有必要针对控制水稻重要农艺性状的功能基因开发基于HRM技术的分子标记，以方便广大分子育种工作者开展诸如种子资源鉴定、定向改良等工作。另外也有必要开发一套覆盖全基因组的背景标记，建立基于HRM技术分子标记公共数据库，加速水稻分子育种工作。

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（责任编辑：柯文辉）