西花蓟马不同RNA干扰技术比较研究

李恒 周知恩 陈勇 陆承聪 张祥琴 王谅 陈艺欣 田厚军 林硕 张洁 游泳 魏辉

摘要：【目的】西花蓟马Frankliniella occidentalis（Pergande）是一种重要的外来入侵害虫，其繁殖能力强、寄主范围广、抗药性强，给我国蔬菜、花卉等经济作物造成了严重危害。本研究旨在评估膜饲喂和显微注射dsActin对西花蓟马Actin基因的沉默效率，以期为蓟马类等小型昆虫基因功能的研究提供方法和依据。【方法】通过膜饲喂和显微注射的方法将体外合成的dsActin导人西花蓟马二龄若虫体内，用RT-qPCR方法检测Actin基因的mRNA表达;通过单头饲养方法观察统计西花蓟马成虫体长、成虫翅膀或胸腹部畸形率及死亡率。【结果】ds，4ctin膜饲喂后24、48、72h，Actin基因的相对表达量分别为对照组的97%、91%和98%;通过显微注射将dsActin注入西花蓟马体腔，在注射后24、48、72h，Actin基因的表达量分别为对照组的68%、56%和53%。注射ds，4ctin的西花蓟马在第24～120h死亡率为44%～98%，显著高于dsGFP对照组;此外，dshctin组个体体长仅为dsGFP对照组的90%，且翅膀或胸腹部出现畸形率为41%。【结论】显微注射dsActin能显著沉默西花蓟马Actin基因mRNA水平的表达，并引起西花蓟马个体不正常发育和死亡，从而建立蓟马类小型昆虫RNAi体系。

关键词：西花蓟马;RNA干扰;膜饲喂法;显微注射法

中图分类号：S433.89

文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2019）10-1179-06

0引言

【研究意义】RNA干扰（RANinterference，RNAi）技术广泛应用于动物、植物和微生物等基因功能的研究。利用转基因技术在植物体表达dsRNA，当昆虫取食带有dsRNA的植物，dsRNA随食物进入到昆虫体内，使昆虫某些功能丧失造成损伤或者死亡，从而达到防治害虫的效果。利用RNAi防治害虫的设想已经在鳞翅目和鞘翅目昆虫上实现。西花蓟马Frankliniella occidentalis（Pergande）是一种危险的入侵害虫，对蔬菜和观赏性植物危害严重，并且其传播的番茄斑萎病毒对寄主植物造成重大损失。西花蓟马虫体小，隐蔽性强，目前常用的防治方法很难有效控制。因此，建立快速有效的西花蓟马RNA干扰技术，对研究西花蓟马的基因功能以及防治蓟马类害虫有重要意义。【前人研究进展】目前将外源dsRNA导人昆虫体内的方式有很多，如饲喂法、注射法、浸泡法、转基因植物表达后昆虫取食等，但是饲喂法和注射法是最常用的两种方法。对于有些昆虫，采用饲喂和注射两种方法都取得较好效果。如烟粉虱通过饲喂dsRNA和显微注射伪蛹和成虫都能有效抑制靶基因的表达;以Pxbursa部分序列的双链RNA（dsRNA）饲喂小菜蛾4龄末期幼虫，发现蛹期Pxbursa的表达受到了显著抑制，小菜蛾的发育停滞在蛹期而无法正常羽化，并最终死亡;利用合成的VgR siRNA注射小菜蛾雌蛹，结果显示16h内VgR的表达受到明显抑制，证明RNAi对小菜蛾有效。饲喂法也在桔小实蝇、柑橘全爪螨、褐飞虱、白背飞虱等昆虫上成功应用，注射法在桔小实蝇、柞蚕、中华按蚊、豌豆长管蚜等昆虫上行之有效。但对有些昆虫饲喂法没有效果，如喂食黑腹果蝇表达dsRNA的酵母没有获得成功;饲喂法也不能有效沉默东亚飞蝗V-ATPaseA/E、CHSl、Kr-hl和Verm基因的表达。应用RNAi抑制害虫靶基因表达在害虫防治中表现出巨大潜力，目前在刺吸式口器的同翅目昆虫蚜虫、叶蝉和粉虱防治上都已得到应用。【本研究切入点】国内外对西花蓟马RNAi的研究成熟经验很少，国内没有关于蓟马RNAi的研究。【拟解决的关键问题】本研究选用膜饲喂法和显微注射法干扰西花蓟马的Actin基因，明确蓟马RNA干扰的合适方法，为小型昆虫基因功能的研究和验证提供依据。

1材料与方法

1.1供试昆虫

西花蓟马由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供，用四季豆饲养于人工气候箱（MGC-350HP-2，上海一恒科技有限公司）。饲养条件为温度25℃，相对湿度60%～70%，光照L：D=14：10h。

1.2西花蓟马Actin基因的扩增验证

根据NCBI西花蓟马Actin基因序列（GenBank登录号：XM 026432071.1）设计Actin砌引物（表1）。西花蓟马总RNA的提取采用Trizol（Ambion公司）法，然后用EasyScript Reverse Transcriptase反转录试剂盒（北京全式金生物科技有限公司）反转成cDNA。再以西花薊马cDNA为模板扩增Actin基因，PCR产物回收纯化（TransGen Biotech，catalognumber：DP209）后连接到T载体上，挑选单菌落进行PCR鉴定，并送上海铂尚生物技术有限公司测序。

1.3dsRNA的合成

根据已扩增验证的西花蓟马Actin基因序列设计合成dsRNA引物，然后在引物的5’端加上T7启动子序列（表1）。用HiScribe T7Quick High Yiel dRNASynthesis Kit（New England Biolabs，美国）先扩增5’端均含有T7启动子序列的DNA片段，随后以获得的DNA片段为模板，用T7转录酶进行体外转录以合成目的基因的dsRNA，用琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA的质量、紫外分光光度计检测浓度，合成的dsRNA置于-80℃备用。

1.4dsRNA稳定性的检测

为了保证dsRNA在膜饲喂和注射过程中的完整性，先将dsRNA分别置于室温12h和24h，然后通过凝胶电泳检测dsRNA的降解情况。

1.5膜饲喂

首先将一块小Parafilm拉伸至很薄覆盖在直径约30mm的饲喂装置上，Parafilm膜的厚薄程度要保证蓟马可以刺破取食液体。在第一层膜上添加饲喂液体50ul（20%蜂蜜水：dsRNA=1：1，dsRNA质量浓度为0.5ug·ul），再覆盖上第二层膜以保护液体不挥发和不受污染，第二层膜上放上四季豆以吸引蓟马到膜附近取食。然后分别将100只蜕皮12h的二龄西花蓟马若虫放置于膜饲喂装置，每隔24h重新更换dsActin。同时对照组饲喂dsGFP。24、48和72h后各取20只活的西花蓟马检测dsRNA的沉默效果。试验重复3次。

1.6显微注射

利用油压式手动微量注射仪（CellTramoil，Eppen.dorf）将质量浓度为0.5ug·ul的dsActin和dsGFP分别注射到200只蜕皮12h的2龄西花蓟马若虫体腔。注射后24、48、72h分别取出20只活虫检测dsRNA的沉默效果。另外，在注射后12h，取30只活虫，单头饲养于放置四季豆的饲养管中，每天观察存活情况和形态变化，共观察5d，统计死亡率、体长和畸形率。同时，羽化后12h在体视镜（型号DMSZ7）下测量体长。试验重复3次。

1.7Real-time PCR检测dsRNA沉默效率

Trizol法提取西花蓟马的总RNA，然后用EasyScript Reverse Transcriptase反转录试剂盒（北京全式金生物科技有限公司）反转录为eDNA。以西花蓟马18S rRNA（GenBank登录号：XM 026420069.1）作为内参基因，分别设计RT-qPCR引物（表1）。参照GoTaq qPCR Master Mix（2x）试剂盒（Promega公司，美国）操作说明配制反应体系，每个样品设3个重复，在BIO-RAD CFX96实时定量PCR仪（Bio-Rad，美国）检测目标基因的表达量。获得的CT值利用2计算目的基因的相对表达水平。

1.8数据分析

不同干扰时间dsRNA处理之间的多重比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA，Tukey HSD test）（SPSS 21.0），差异显著性检验水平标准P<0.05。

2结果与分析

2.1西花蓟马Actin基因克隆验证

根据NCBI上西花蓟马的Actin序列（GenBank登录号：XM 026432071.1）设计引物，PCR扩增及测序结果表明，Actin基因完整的开放性阅读框长度为1131bp，编码376个氨基酸（图1-2），与已经报道的西花蓟马Actin基因序列一致。

2.2dsRNA稳定性

琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，dsRNA放置24h后仍然保持较好的完整性（图3）。因此膜饲喂进入蓟马体内的dsRNA是完整的。

2.3膜饲喂和显微注射dsActin对西花蓟马Actin基因表达的影响

RT-qPCR检测结果表明，与对照组饲喂dsGFP相比，膜饲喂dsActin24h、48h和72h后，Actin基因的相对表达量分别为对照组的97%、91%和98%，这表明通过膜饲喂dsActin对西花蓟马Actin基因表达抑制作用不显著（图4）。相反，通过显微注射将ds-Actin注入西花蓟马体腔，在注射后24、48和72h，Actin基因的表达量分别为对照组的68%、56%和53%（图5），与对照组均有显著差异（P<0.05）。

2.4注射dsActin对西花蓟马存活率和形态的影响

由2.3可知，显微注射质量浓度为0.5ug.uL的dsActin可显著抑制西花蓟马Actin基因的表达，观察发现，注射dsGFP的西花蓟马在第24-120h后的死亡率为29%-52%，而注射dsActin基因的西花蓟马死亡率在第24-120h达44%-98%（图5-A）;同时，注射dsActin的西花蓟马成虫翅膀或胸腹部畸形率为41%（图5-B-C），且个体体长只有注射dsGFP的对照组的90%左右（图5-D）。说明注射dsActin成功干扰了西花蓟马的Actin基因，并对其生长发育产生了影响。

3讨论与结论

RNA干扰是由双链RNA介导、引起目的基因mRNA序列特异性降解的基因沉默的一个过程。通过RNAi沉默靶标基因是当前研究昆虫基因功能的重要手段。飼喂法、注射法、浸泡法、直接取食转基因植物等是将外源dsRNA导入昆虫体内的常用方式。已有研究表明，饲喂dsRNA的干扰效率明显低于将其注射到昆虫体腔，如在棉铃虫的RNAi试验中，仅饲喂一次很难产生明显的RNAi效应，连续饲喂才与注射一次的RNAi效果相。本研究通过比较膜饲喂和微针注射dsActin两种方式沉默西花蓟马Actin基因，结果表明，微针注射方式成功实现了对目的基因的干扰;尽管通过增加膜饲喂次数来增加摄入昆虫体内dsRNA的量，但是72h后仍然不能有效沉默目的基因。因此，微针注射dsRNA是沉默西花蓟马目的基因的有效方式，该结果为后续西花蓟马及小型昆虫基因功能的研究提供了技术手段。

基于注射法的RNA干扰方法能减小昆虫表皮或者中肠障碍，使dsRNA快速进入体腔或者血淋巴，同时还能准确控制进入虫体的dsRNA剂。本研究表明，显微注射方式虽然具有干扰效果好的优点，但是注射会对昆虫造成直接的物理损伤，增加昆虫死亡率。因此，在注射时要选择合适的针头、注射体积、注射位置，尽量避免损伤昆虫。此外，显微注射前较常用的麻醉方法有乙醚麻醉法、二氧化碳麻醉法和冰冻麻醉法等，选择合适的麻醉方法能降低昆虫死亡率。本研究发现在蓟马麻醉过程中，二氧化碳麻醉法具有速度快、损伤小的优点。

综上所述，显微注射dsRNA是沉默蓟马目的基因的有效方式，适于开展蓟马类小型昆虫基因功能分析，筛选防控靶标基因，同时在应用过程中，还需要综合考虑各种因素，从而提高RNA干扰效果。