解淀粉芽孢杆菌液体肥在茶叶上的应用研究

林斌 黄菊青 官雪芳 郑炎 徐庆贤 王琦 钱蕾 郑怡 张臣心 汤铜华 赵孟涛

摘要：【目的】考察解淀粉芽孢杆菌Bacillus Amyloliquefaciens液体肥w208YF施用对铁观音乌龙茶产量、品质和茶园土壤相关指标的影响。【方法】采用田间小区试验，设w208YlF（解淀粉芽孢杆菌液体肥，菌液浓度为4.00×10cfu·mL，使用量100L·hm）和等量清水对照（cK）2個处理，重复4次，进行差异性比较。【结果】w208YF处理的茶叶产量、水浸出物含量和游离氨基酸总量较cK均显著增加，增幅分别为11.10%、10.60%和8.10%，而茶叶咖啡碱含量则显著下降，降幅为24.30%;同时，w208YF的茶园土壤肥力（全氮、碱解氮、有效磷、速效钾、有机质和腐殖酸含量）及微生物多样性指数（shannon、simpson指数及β多样性）均明显优于cK。【结论】施用解淀粉芽孢杆菌液体肥w208YF能够明显提升茶园土壤肥力及微生物群落多样性，并显著提高茶叶产量和品质。

关键词：解淀粉芽孢杆菌;液体肥;茶叶;生化品质;土壤肥力

中图分类号：S571.1 文献标志码：A 文章编号：1008.0384（2019）10-1173-06

0引言

【研究意义】作为世界上的主要产茶国，中国国内茶叶消费近年来快速增加，中国产业信息网数据显示2017年中国茶叶消费量达到193万t左右，比2015年增长12.21%。同时期全球茶叶消费量由2015年的500万t增加到2017年的544万t，无论是从增长的绝对值，还是增长幅度，中国都已成为全球发展最快和潜力最大的茶叶市场。施肥是提高茶叶产量、品质和茶园可持续发展最重要的农业措施之一。近年来，茶园化肥的盲目使用和不合理的施肥模式引起的茶园生态环境问题日益凸显，开发能够促进茶园可持续发展的环保高效肥料，显得尤为重要与迫切。【前人研究进展】目前关于茶叶施肥的研究已有较多报道，但主要为化肥、有机肥和豆科绿肥的施用，微生物肥料在茶园中的应用报道较少。Kim等研究表明解淀粉芽孢杆菌发酵液能够显著促进西瓜的生长。周晨光等研究表明解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂能够显著提高茶叶产量和品质。微生物肥料是活体肥料，是21世纪的新型肥料，是一种低碳、纯天然、无毒、无害、无污染的微生物菌剂。它主要靠大量有益微生物的生命活动代谢来完成，可提高土壤肥力，增加土壤中有益微生物数量及活性，改善土壤性状，防止土壤板结，提高土壤保肥、保水及抗寒、抗病能力，阻止病原菌入侵，减少植物的病虫害，促进农作物生长，提高农作物产量，改善和还原农产品品质等。微生物肥料从形态来分有固体和液体两种。其中液体微生物肥料以其速溶、均匀、即用、能够喷灌和浇灌以及不易吸湿和结块等优势受到种植行业的青睐。【本研究切入点】解淀粉芽孢杆菌Bacillus amy-lotiquefaciens是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，它属于植物促生菌，具有很强的生命力和定植能力，但尚未见该菌剂对茶园土壤肥力及微生物多样性影响的报道。【拟解决的关键问题】本研究在福建省龙岩市上杭县蛟潭茶场开展试验，探讨茶园施用解淀粉芽孢杆菌液体肥对茶叶产量、品质以及茶园土壤肥力和微生物多样性的影响，为茶园微生物肥料的应用及茶叶的可持续发展提供参考。

1材料与方法

1.1材料

解淀粉芽孢杆菌W208YF：由本课题组从含腐烂稻草的农田土壤中分离筛选得到，该菌株于2016年9月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.13006。

解淀粉芽孢杆菌液体肥W208YF：将解淀粉芽孢杆菌W208接种到LB培养基上，在37°C恒温摇床中，180r·min振荡培养24h，制成液体种子;按质量体积比为5%的接种量将液体种子接种于发酵罐内的发酵培养基（以马铃薯淀粉废水为原料，添加豆粕粉20g·L，调节pH值为7.00，在121℃灭菌20min），曝气，于37%下发酵72h，在发酵第24h第一次补充发酵培养基，补液体积为补充前发酵液体积的50%，在发酵第56h第二次补充发酵培养基，补液体积为补充前发酵液体积的30%，发酵72h时检测其含解淀粉芽孢杆菌活菌数为2.06×10cfu·mL，收集发酵液，即得解淀粉芽孢杆菌液体肥W208YF。

1.2试验方法

1.2.1试验设计试验地情况：福建省龙岩市上杭县蛟潭茶场（海拔1000m左右），茶树品种为铁观音，树龄12年。栽植方式为畦栽密植，栽植密度45000～60000株.hm。该茶园基础土壤肥力：pn为5.80，全氮0.20%，全磷0.03%，全钾1.12%，碱解氮138.10mg·kg，有效磷106.70mg·kg，速效钾297.00mg.kg，有机质4.50%，腐殖酸1.71%。

试验设空白对照（CK）和W208YF 2个处理，重复4次，每个处理小区面积333m。W208YF处理施用解淀粉芽孢杆菌液体肥，使用前用发酵培养基稀释50倍（菌液终浓度约为4.00×10cfu·mL），施用量：100L·hm，于2016年8月10日和9月1日分别进行叶面喷施和沟施，用量各占50%;空白对照施用等量清水。

于2016年10月20日按“s”法进行布点，沿茶树树冠滴水线挖30cm的剖面，在剖面上均匀采集土壤250g，取8个采样点土壤混合，四分法取500g土样，采摘按中小开面3～4叶新梢并分小区计产。统一按铁观音做青工艺加工，制成干茶，测定茶叶品质生化成分、茶园土壤肥力和微生物多样性。

1.2.2茶叶品质检测

茶叶水浸出物测定参照《GBT8305-2013茶水浸出物测定》。

游离氨基酸总量参照《GBT8314-2013茶游离氨基酸总量的测定》。

茶多酚测定参照《GBT 8313-2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》。

咖啡碱测定参照《GBT 8312-2013茶咖啡碱测定》。

1.2.3茶园土壤肥力及微生物多样性检测pH、有机質、碱解氮、有效磷、速效钾、全氮、全磷、全钾，腐殖酸含量分别根据NY/T 1377-2007、NY/T1121.6_2006、《土壤农业化学分析法》、NY/T1121.7-2006、NY/T 889_2004、NY/T 53.1987、NY/T88-1988、NY/T 87-1988、《土壤农业化学分析法》进行检测。茶园土壤微生物检测：按试剂盒说明书（FastDNA SPINKitforSoil，美国MPBIO公司）提取土壤总DNA，采用16S和ITSMiseqPE300测序平台对16S rDNA的V3-V4区进行扩增测序分析，采用QIIME分析软件分析土壤微生物多样性。

1.3数据分析

数据以平均值±标准差（x+SD）表示，采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，组间比较采用Duncan多重比较法，以P<0.05表示组问具有显著差异。

2结果与分析

2.1施用解淀粉芽孢杆菌液体肥W208YF对茶叶产量和品质的影响

由表1可看出，与CK相比，W208YF处理茶叶的产量显著增加（P<0.05），增幅为11.10%。同时，生化指标检测结果显示，W208YF处理茶叶的水浸出物含量和游离氨基酸含量均显著增加（P<0.05），二者相对于CK的增幅分别为10.60%和8.10%，而咖啡碱含量显著降低（P<0.05），降低幅度为24.30%，茶多酚含量稍有增加，但差异不显著（P>0.05），说明施用W208YF可显著优化茶叶品质生化成分。

2.2施用解淀粉芽孢杆菌液体肥W208YF对茶园土壤肥力的影响

表2显示，与CK比，W208YF处理茶园土壤的全氮、碱解氮、有效磷、速效钾、有机质和腐殖酸含量均显著增加（P<0.05），增幅分别达76.30%、81.40%、53.00%、30.50%、81.70%和73.90%，说明施用W208YF能够显著提高茶园土壤肥力。

2.3施用解淀粉芽孢杆菌液体肥W208YF对茶园土壤微生物多样性的影响

土壤微生物是土壤生物的重要组成部分，在土壤结构形成、有机物质分解与转化、营养元素循环与利用、作物生长和生态环境改善、植物病害抑制或拮抗、温室气体排放等方面起着重要的作用，是土壤肥力的重要调控因子和土壤地力的关键驱动因子之一，可敏感反映土壤质量变化、表征土壤有机质代谢旺盛程度，是评价土壤质量的主要指标之一。本研究采用16s rDNA法对茶园土壤微生物进行鉴定，采用ACE、Cha01、Shannon和Simpson等指数来评估施用解淀粉芽孢杆菌液体肥W208YF对茶园土壤微生物多样性的影响。其中ACE和Cha01表示群落中含有OTU数目，以估计群落中实际存在的物种数和物种总数，ACE和Cha01指数越大，表明群落的丰富度越高。

表3结果显示，施用解淀粉芽孢杆菌液体肥W208YF的茶园土壤微生物群落Shannon及Simpson指数明显较CK更高（p<0.05），说明施用W208YF可显著提高茶园土壤微生物群落的丰富度和均匀度。

微生物群落的β多样性一般可采用有度量多维标定法PCoA（Prineipal Coordinate Analysis，主坐标分析）法进行，该方法将样品排在一定的空间内，可体现出样品间的空间差异。通过PCoA法对CK和W208YF处理（每处理4个重复）茶园土壤微生物群落差异进行分析，结果如图1所示。由图1可看出，W208YF处理与CK能够明显的区分开来，说明施用W208YF能够显著调节茶园土壤的微生物群落结构。

3讨论与结论

解淀粉芽孢杆菌已被证实对多种作物如玉米、小麦、番茄、黄瓜等多种农作物均有良好的促生作用，它主要通过改变土壤营养元素的存在形态或分泌生长素促进作物生长，改善作物品质。本研究通过自主筛选获得一株解淀粉芽孢杆菌W208YF，研究表明该菌可显著增加茶叶产量，显著提高茶叶水浸出物、游离氨基酸和茶多酚的含量，这与周晨光等报道的结果相一致，进一步证实淀粉芽孢杆菌可提高茶叶产量、改善品质。另外，与解淀粉芽孢杆菌亲缘性极高的枯草芽孢杆菌也被证实对可显著提高茶叶的产量，是否提高茶叶产量是该类菌的共性还有待进一步研究。

土壤微生物是土壤有机质和养分转化与循环的主要驱动力，现有研究表明使用菌肥可以提高土壤的肥力和作物产量，如张姗姗等采用4种不同产家的菌肥施用西藏桃后，显著提高了桃树土壤中机碳、碱解氮、全氮、速效钾、速效磷及全磷含量，改善了土壤肥力，提高西藏桃产量和品质。杨超才等在植烟土壤中施用枯草芽孢杆菌后，土壤碱解氮、速效磷、土壤有机质含量显著增加。本研究首次使用解淀粉芽孢杆菌作为菌肥用于茶园，发现施用菌W208YF液体肥后可显著提高碱解氮、有效磷、速效钾、有机质和腐殖酸含量，提高幅度高达30.50%～81.70%，证实菌W208YF亦可提高土壤肥力。曾令涛等研究表明解淀粉芽孢杆菌x益生菌的添加活化了土壤养分，增加了土壤细菌、放线菌、解淀粉芽孢杆菌和荧光假单胞菌数量，降低了土壤真菌数量，显著提高了土壤酶活性。本研究也发现施用菌W208YF液体肥后土壤微生物群落结构也发生了显著的变化，说明菌W208YF可显著调整土壤原土著微生物的群落结构，形成的新的微生物群落更能驱动土壤N、P、K有效态的转化，促进有机质的和腐殖酸的转化形成，提高土壤营养成分并促进铁观音茶对土壤营养元素的吸收，进而提高铁观音茶的产量和质量。

茶叶咖啡碱是茶叶中重要的风味物质，它通过兴奋中枢神经，达到提神醒脑、兴奋心脏等功效，长期饮用富含咖啡碱的茶叶将使人体对咖啡碱产生依赖症，对人体产生不利影响;美国、日本等国家甚至对茶制品中的咖啡碱的含量进行了限量规定。基于此，为了降低茶叶中咖啡碱的含量，研究人员在优化提取工艺降低咖啡碱含量、杂交育种选育、基因工程筛选低含量咖啡碱方面进行大量的研究。本研究使用菌W208YF菌肥喷洒茶叶后，发现茶叶咖啡碱的含量仅为1.18g'hg，显著低于普通茶叶含量中的2%～5%，与对照组相比降低幅度高达24.30%，大大高于周晨光等研究中对咖啡碱降低6.36%的幅度，提示可通过施用解淀粉芽孢杆菌W208YF生产出低咖啡碱含量铁观音茶叶，为开发适合高血压等人群饮用的低咖啡碱含量茶制品提供了理想的原料来源。关于解淀粉芽孢杆菌降低茶叶咖啡碱机制尚不清晰，相关研究有待进一步深入。