罗汉松内生真菌Pestalotiopsis heterocornis的代谢产物研究

鲍真真 吴洁 王奎武 吴斌 钟嫄

摘 要：从罗汉松内生真菌Pestalotiopsis heterocornis 的发酵培养液中分离得到10个代谢产物，应用质谱、核磁共振等现代波谱学方法鉴定为 jesterone（1），hydroxy-jesterone（2），ambuic acid（3），6β-羟基-豆甾-4-烯-3-酮（4），（24S）-麦角甾-5-烯-3β， 7α-二醇（5），7， 22-二烯-3β， 5α， 7β-三羟基-麦角甾醇（6），麦角甾-7， 22-二烯-3-酮（7），（4E， 8E， 2S， 3R， 2′R）-N-2′-羟基棕榈酰-9-甲基-4， 8-sphingadienin（8），鲨肝醇（9），棕榈酸（10）。以上化合物均为首次从内生真菌P. heterocornis 的代谢产物中分离得到，化合物 4，6，7 为首次从拟盘多毛孢属真菌代谢产物中分离得到。

关键词：内生真菌， Pestalotiopsis heterocornis， 代谢产物

中图分类号：Q946

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2019）11-1568-05

Abstract：Ten compounds were isolated and identified from endophytic fungi Pestalotiopsis heterocornis， isolated from Podocarpus macrophyllus， which collected in Hangzhou， China. Their structures were elucidated on the basis of spectroscopic data as jesterone（1）， hydroxy-jesterone（2）， ambuic acid（3）， 6β-Hydroxystigmast-4-en-3-one（4），（24S）-ergosta-5-en-3β， 7α-diol（5）， ergosta-7， 22- dien-3β， 5α， 7β-triol（6），ergosta-7， 22-dien-3-one（7），（4E， 8E， 2S， 3R， 2′R）-N-2′-hydroxyhexadecanoyl-9-methyl-4， 8-sphingadienin（8）， batyl alcohol（9）， palmitic acid（10）. All compounds were isolated from P. heterocornis for the first time， and compounds 4， 6， 7 were obtained for the first time from Pestalotiopsis spp.

Key words：endophytic fungi， Pestalotiopsis heterocornis， metabolites

內生真菌普遍存在于健康植物组织中，种类繁多，分布广泛。植物内生真菌的代谢产物十分丰富而且具有许多活性，如调节植物生长、杀虫、抑菌、抗肿瘤等（Gunatilaka， 2006; Tan & Zou 2001;孙剑秋等， 2006;马养民和冯成亮， 2008）。近年来，内生真菌成为了发现新的活性化合物和先导化合物的重要来源，对其代谢产物中活性物质的研究受到越来越多的关注。植物内生拟盘多毛孢（Pestalotiopsis） 是植物内生真菌的重要类群，拟盘多毛孢能产生多种代谢产物，包括抗癌物质、抗菌物质等，其中微孢拟盘多毛孢（P. microspora） 菌株的紫杉醇产量已初步显示其商业潜力，因而引起了人们对内生拟盘多毛孢研究的兴趣（Liu et al.， 2008， 2009; Li et al.， 2008; Li et al.， 2011; Ding et al.， 2009）。

本文报道罗汉松内生真菌（Pestalotiopsis heterocornis）的代谢产物的研究。从中分离得到 10 个化合物， 分别鉴定其结构为 jesterone（1），hydroxy-jesterone（2），ambuic acid（3），6β-羟基-豆甾-4-烯-3-酮（4），（24S）-麦角甾-5-烯-3β， 7α-二醇（5），7， 22-二烯-3β， 5α， 7β-三羟基-麦角甾醇（6），麦角甾-7， 22-二烯-3-酮（7），（4E， 8E， 2S， 3R， 2′R）-N-2′-羟基棕榈酰-9-甲基-4， 8-sphingadienin（8），鲨肝醇（9），棕榈酸（10）。

1 材料

Bruker 500 AVANCE Ⅲ 型核磁共振仪，内标为TMS（实验所测 1H-和13C-NMR 分别为500，125MHz）;X-4 数字显示显微熔点测定仪（温度计未校正）;Nicolet NEXUS-470 型红外光谱仪（溴化钾压片）;Thermo LCQ FLEET 型电喷雾质谱仪（ESI-MS，APCI-MS）;Waters 600 Pre-HPLC（美国Waters 公司）;色谱柱用硅胶（青岛海洋化工厂）;Sephadex LH-20（美国 Pharmaeia 公司）;GF254高效薄层板（烟台汇友硅胶开发有限公司）;实验所用试剂均为分析纯。菌种筛自江苏南京罗汉松（Podocarpus macrophyllus），由南京中医药大学药学院谈献和教授鉴定为Pestalotiopsis heterocornis，标本保存于实验室。

PDA发酵培养基配制：称取200 g马铃薯，洗净去皮后切成小块，加水1 000 mL 煮沸30 min，纱布过滤，在滤液中加入20 g葡萄糖，充分溶解后，分装。

2 提取分离

罗汉松内生真菌Pestalotiopsis heterocornis发酵液（20 L，1 L锥形瓶装500 mL左右培养基，室温静止发酵20 d，每次发酵40瓶）用乙酸乙酯萃取 3 次，合并减压蒸干得 3.5 g 粗提物，经硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇梯度洗脱得 6 个馏份（Fr. A - Fr. F）。Fr. B（氯仿∶甲醇 95∶5 洗脱部分） 经 Sephadex LH-20 柱色谱分离，以氯仿∶甲醇（1∶1） 洗脱得 2 个亚组份Fr. B1和 Fr. B2，Fr. B1 经硅胶柱色谱分离，以石油醚∶乙酸乙酯（10∶1） 洗脱得到化合物 4（15.3 mg），Fr. B2 经过重结晶得到化合物 7（11.2 mg）;Fr.C（氯仿∶甲醇 90∶10 洗脱部分）经硅胶柱色谱分离，以石油醚∶丙酮（8∶1）洗脱得 2 个亚组份，其中 Fr. Cl 再经硅胶柱色谱分离，以纯氯仿洗脱得到化合物 1 和化合物2 的混合物（32.2 mg）， 该混合物经 Pre-HPLC（流动相甲醇-水 80∶20） 制备得到化合物 1（8.0 mg） 和化合物2（12.1 mg），Fr.C2 经重结晶得到化合物 5（6.9 mg）;Fr.D（氯仿∶甲醇 85∶15 洗脱部分） 经硅胶柱色谱分离，以氯仿∶丙酮（15∶1） 洗脱得 3 个亚组份，Fr. D1 再经硅胶柱色谱分离，以石油醚∶丙酮（5∶1） 洗脱得到化合物 8（7.2 mg），Fr.D2 经 Sephadex LH-20 柱色谱分离，以氯仿∶甲醇（1∶1） 洗脱得化合物 6（16.2 mg），Fr. D3经Pre-HPLC（流动相甲醇∶水∶乙酸 7∶3∶0.1） 制备得到化合物 3（8.2 mg）;Fr. E 再经硅胶柱色谱分离得到化合物 9（10.1 mg） 和化合物10（6.5 mg）。

3 结构鉴定

化合物1 淡黄色液体， C15H20O4; ESI-MS m/z： 263[M-H]-; 1H NMR（CDCl3） δ：1.80（1H， d， J=6.6 Hz， Me-1）， 5.82（1H， dt， J=6.6 Hz， 17.3 Hz， H-2）， 6.01（1H， d， J=17.3 Hz， H-3）， 4.83（1H， d， J=1.3 Hz， H-6）， 3.64（1H， d， J=1.3 Hz， H-7）， 2.75（1H， dd， J=8.0 Hz， 16.2 Hz， H-9a）， 2.56（1H， dd， J=7.0 Hz， 16.2 Hz， H-9b）， 5.00（1H， m， H-10）， 4.68（1H， d， J=15.4 Hz， H-12a）， 4.40（1H， d， J=15.4 Hz， H-12b）， 1.60（3H， s， Me-14）， 1.67（3H， s， Me-15）; 13C NMR（CDCl3） δ：19.3（C-1）， 135.2（C-2）， 122.1（C-3）， 131.7（C-4）， 145.4（C-5）， 65.5（C-6）， 59.4（C-7）， 60.2（C-8）， 26.7（C-9）， 116.7（C-10）， 136.2（C-11）， 63.1（C-12）， 195.0（C-13）， 18.2（C-14）， 25.8（C-15）。以上數据与文献（Li & Strobel， 2001b） 报道基本一致，故鉴定为jesterone。

化合物2 淡黄色液体， C15H20O5; ESI-MS m/z： 279[M-H]-; 1H NMR（CDCl3） δ：1.81（1H， d， J=6.4 Hz， Me-1）， 5.80（1H， dd， J=6.4 Hz， 15.3Hz， H-2）， 6.00（1H， d， J=15.3 Hz， H-3）， 4.80（1H， s， H-6）， 3.82（1H， s， H-7）， 4.92（1H， d， J=8.1 Hz， H-9）， 5.08（1H， d， J=8.1 Hz， H-10）， 4.64（1H， d， J=15.0 Hz， H-12a）， 4.40（1H， d， J=15.0 Hz， H-12b）， 1.68（3H， s， Me-14）， 1.70（3H， s， Me-15）; 13C NMR（CDCl3） δ：19.2（C-1）， 135.0（C-2）， 122.1（C-3）， 131.5（C-4）， 145.6（C-5）， 64.4（C-6）， 58.2（C-7）， 60.4（C-8）， 65.5（C-9）， 120.5（C-10）， 139.2（C-11）， 61.1（C-12）， 195.1（C-13）， 18.5（C-14）， 25.8（C-15）。以上数据与文献（Li & Strobel， 2001b） 报道基本一致，故鉴定为hydroxy-jesterone。

化合物3 针状结晶（CH3OH/CHCl3）; C19H26O6; ESI-MS m/z：349[M-H]-; 1H NMR（CDCl3） δ：6.58（1H， t， J=7.3 Hz， H-3）， 2.80（1H， dd， J=15.8Hz， 7.3 Hz， H-4）， 3.78（1H， d， J=3.2 Hz， H-6）， 4.82（1H， d， J=3.2 Hz， H-7）， 6.17（1H， d， J=16.4 Hz， H-11）， 5.82（1H， m， H-12）， 2.12（1H， m， H-13）， 1.43（2H， m， H-14）， 1.33（2H， m， H-15）， 1.32（2H， m， H-16）， 0.95（3H， t， J=8.0 Hz， Me-17）， 1.83（3H， s， Me-18）， 4.40（1H， d， J=13.4 Hz， H-19a）， 4.52（1H， d， J=13.4 Hz， H-19b）; 13C NMR（CDCl3） δ：171.7（C-1）， 132.2（C-2）， 136.4（C-3）， 28.5（C-4）， 61.4（C-5）， 61.1（C-6）， 66.4（C-7）， 150.3（C-8）， 132.5（C-9）， 196.5（C-10）， 122.2（C-11）， 140.1（C-12）， 34.2（C-13）， 30.3（C-14）， 32.8（C-15）， 23.8（C-16）， 14.4（C-17）， 13.2（C-18）， 60.8（C-19）。以上数据与文献（Li et al.， 2001a） 报道基本一致，故鉴定为ambuic acid。

化合物 4 无色针状结晶， C29H48O2; m. p. 213～215 ℃; APCI-MS m/z：427[M-H]-， 451[M+Na]+; 1H-NMR（CDCl3） δ：5.80（1H， s， H-4）， 4.34（1H， s， H-6）， 0.75（3H， s， Me-18）， 1.38（3H， s， Me-19）， 0.93（3H， d， J=6.5 Hz， Me-21）， 0.82（3H， d， J=6.1 Hz， Me-26）， 0.84（3H， d， J=6.1 Hz， Me-27）， 0.85（3H， t， J=6.7 Hz， Me-29）; 13C-NMR（CDCl3） δ：37.3（C-1）， 34.5（C-2）， 200.6（C-3）， 126.6（C-4）， 168.7（C-5）， 73.5（C-6）， 38.8（C-7）， 30.0（C-8）， 53.9（C-9）， 38.2（C-10）， 21.2（C-11）， 38.9（C-12）， 42.8（C-13）， 56.3（C-14）， 24.4（C-15）， 28.4（C-16）， 56.1（C-17）， 12.2（C-18）， 19.7（C-19）， 36.3（C-20）， 19.0（C-21）， 34.6（C-22）， 26.4（C-23）， 46.1（C-24）， 29.4（C-25）， 20.0（C-26）， 19.3（C-27）， 23.3（C-28）， 12.2（C-29）。以上數据与文献（Arai et al.， 1998） 报道基本一致，故鉴定为6β-羟基-豆甾-4-烯-3-酮。

化合物 5 无色针状结晶（丙酮）， C28H48O2; m. p. 216-218 ℃; APCI-MS m/z：415[M-H]-， 439[M+Na]+：1H NMR（CDCl3） δ：3.55（1H， m， H-3）， 5.60（1H， d， J=5.5 Hz， H-6）， 3.83（1H， d， J=5.5 Hz， H-7）， 0.68（3H， s， Me-18）， 0.98（3H， s， Me-19）， 0.91（3H， d， J=6.5 Hz， Me-21）， 0.83（3H， d， J=6.8 Hz， Me-26）， 0.76（3H， d， J=6.8 Hz， Me-27）， 0.74（3H， d， J=6.9 Hz， Me-28）; 13C NMR（CDCl3） δ：37.7（C-1）， 31.5（C-2）， 71.7（C-3）， 42.0（C-4）， 146.5（C-5）， 125.7（C-6）， 65.4（C-7）， 38.4（C-8）， 42.3（C-9）， 37.8（C-10）， 21.5（C-11）， 39.0（C-12）， 42.4（C-13）， 50.0（C-14）， 24.4（C-15）， 28.9（C-16）， 55.8（C-17）， 18.6（C-18）， 11.6（C-19）， 36.4（C-20）， 20.0（C-21）， 33.6（C-22）， 30.5（C-23）， 39.4（C-24）， 31.3（C-25）， 17.6（C-26）， 20.7（C-27）， 15.7（C-28）。以上数据与文献（张广文等， 2003） 报道基本一致，故鉴定为（24S）-麦角甾-5-烯-3β， 7α-二醇。

化合物 6 无色针状结晶（甲醇）， C28H46O3; m. p. 224-226 ℃; ESI-MS m/z：429[M-H]-， 453[M+Na]+; 1H NMR（DMSO-d6） δ：3.75（1H， m， H-3）， 3.40（1H， s， H-6）， 5.10（1H， s， H-7）， 5.15（1H， dd， J=15.5 Hz， 3.0 Hz， H-22）， 5.20（1H， dd， J=15.5 Hz， 3.0 Hz， H-23）， 0.58（3H， s， Me-18）， 0.92（3H， s， Me-19）， 0.97（3H， d， J=6.5 Hz， Me-21）， 0.81（3H， d， J=6.9 Hz， Me-26）， 0.83（3H， d， J=6.7 Hz， Me-27）， 089（3H， d， J=7.1 Hz， Me-28）; 13C NMR（CDCl3） δ：32.7（C-1）， 31.3（C-2）， 65.7（C-3）， 40.0（C-4）， 74.5（C-5）， 72.3（C-6）， 119.4（C-7）， 139.4（C-8）， 42.3（C-9）， 36.8（C-10）， 21.4（C-11）， 39.0（C-12）， 42.8（C-13）， 54.3（C-14）， 22.4（C-15）， 27.7（C-16）， 55.5（C-17）， 12.3（C-18）， 17.6（C-19）， 39.4（C-20）， 20.8（C-21）， 135.6（C-22）， 131.5（C-23）， 42.2（C-24）， 32.3（C-25）， 19.6（C-26）， 19.7（C-27）， 17.5（C-28）。以上数据与文献（吕子明等， 2008） 报道基本一致，故鉴定为麦角甾-7， 22-二烯-3β， 5α， 7β-三醇。

化合物 7 无色针状结晶（氯仿）， C28H44O; m. p.179-181 ℃; APCI-MS m/z：419[M+Na]+; 1H NMR（CDCl3） δ：0.55（3H， s， Me-18）， 0.81（3H， d， J=6.4 Hz， Me-26）， 0.83（3H， d， J=6.4 Hz， Me-27），0.90（3H， d， J=6.6 Hz， Me-28）， 1.03（3H， s， Me-19）， 1.04（3H， d， J=7.4 Hz， Me-21）， 5.21（3H， m， H-7， H-22和H-23）。13C NMR（CDCl3） δ：38.6（C-1）， 38.3（C-2）， 212.1（C-3）， 44.2（C-4）， 42.6（C-5）， 30.4（C-6）， 117.3（C-7）， 139.3 C-8）， 48.6（C-9）， 34.4（C-10）， 21.4（C-11）， 39.3（C-12）， 43.4（C-13）， 55.8（C-14）， 22.7（C-15）， 28.2（C-16）， 55.1（C-17）， 12.1（C-18）， 12.4 C-19）， 40. 5（C-20）， 19.7（C-21）， 135.4（C-22）， 132.1（C-23）， 42.7（C-24）， 33.1（C-25）， 19.8（C-26）， 21.0（C-27）， 17.6（C-28）。以上数据与文献（王雪芹等， 2007） 报道基本一致，故鉴定为麦角甾-7， 22-二烯-3-酮。

化合物 8 白色无定型粉末， C35H67NO4; ESI-MS m/z：564[M-H]-; 1H NNR（CD3COCD3） δ：0.89（6H， t， J=7.2 Hz， Me-18/16′）， 1.18-1.43（40H， m）， 1.59（3H， s， Me-19）， 1.76（1H， m， H-3′）， 1.98（2H， t， J=7.2 Hz， H-10）， 2.02（1H， m， H-3′）， 2.08（4H， m， H-6/7）， 3.65（1H， m）， 3.81（2H， m）， 4.01（2H， m）， 4.15（1H， m）， 4.40（1H， d， J=5.2 Hz）， 4.75（1H， d， J=5.6 Hz）， 5.14（1H， m， H-8）， 5.55（1H， dd， J=15.5 Hz， 6.3 Hz， H-4）， 5.68（1H， m， H-5）， 7.31（1H， d， J=7.4 Hz， NH）; 13C NMR（CD3COCD3） δ：14.4， 16.1， 23.4， 28.4， 28.5， 29.3-29.9， 32.5， 33.3， 35.7， 40.2， 56.3， 62.3， 72.7， 73.6， 124.7， 131.6， 132.4， 136.2， 175.1。以上數据与文献（周忠玉和刘吉开， 2009） 报道基本一致，故鉴定为（4E， 8E， 2S， 3R， 2′R）-N-2′-羟基棕榈酰-9-甲基-4， 8-sphingadienin。

化合物 9 无色针状晶体（CH3OH/CDCl3），C21H44O3; ESI-MS m/z：343[M-H]-; 1H NMR（CDCl3 ） δ：0. 92（3H， t， J=5.9 Hz， Me-18）， 1.12-1.48（32H， br， s）， 2.66（1H， m）， 2.32（1H， m）， 3.3-4.2（7H， m）; 13C NMR（CDCl3） δ：14.2（Me-18）， 22. 7， 22.8， 26.3， 32.0， 29.3-29.9， 64.3， 70.2， 72.2， 72.8。以上数据与文献（蓝文健等， 2003） 报道基本一致，故鉴定为鲨肝醇。

化合物 10 白色粉末， C16H32O2; ESI-MS m/z： 255[M-H]-; 1H NMR（CDCl3） δ：2.33（2H， t， J=7.4 Hz， H-2）， 1.62（2H， m， H-3）， 1.22-1.30（24H， m， H-4～H-15）， 0.89（3H， t， J=7.4 Hz， Me-16）。13C NMR（CDCl3） δ：179.9（C-1）， 34.3（C-2）， 31.8（C-15）， 29.4-29.9（C-3～C-14）， 14.2（C-16）。结合质谱和核磁数据鉴定该化合物为棕榈酸（十六烷酸）。

致谢 感谢南京中医药大学药学院谈献和教授在鉴定工作方面提供的大力帮助。

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