解淀粉芽孢杆菌B1619对连作西瓜生长及枯萎病发生的影响
2019-09-10王夏雯孟佳丽刘永锋陈志谊张智慧余翔
王夏雯 孟佳丽 刘永锋 陈志谊 张智慧 余翔
摘要：【目的】明确解淀粉芽孢杆菌B1619对连作西瓜枯萎病的防效，并探讨其合理施用方法。【方法】在连续种植4年西瓜的土壤环境下，采用随机区组设计，研究供试微生物菌剂在不同施用方式和施用剂量下，对连作西瓜生长、枯萎病发生及根际土壤主要菌群的影响。【结果】解淀粉芽胞杆菌B1619采用穴施方式、剂量（18+9）g穴-1时对连作西瓜的增产率达到43.20%，中心糖、边糖、商品率均显著增加。该施用方法有效改变了连作西瓜根际的菌群环境，其中细菌数量在开花期和成熟期分別是对照的1.93倍和1.27倍，病原菌尖抱镰刀菌数量分别降低为对照的33.38%和37.19%。【结论】解淀粉芽胞杆菌B1619采用穴施方式、剂量（18+9）g·穴-1，对4年连作西瓜产量、品质提升，西瓜枯萎病防治效果最好。
关键词：解淀粉芽胞杆菌;设施西瓜枯萎病;施用技术;生防效果
中图分类号：S435 文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2019）11-1302-07
0 引言
【研究意义】西瓜忌连作，通常轮作年限需超过6年，但随着设施西瓜栽培面积不断增加，采用轮作方式越发困难，连作栽培已不可避免。西瓜连作后会出现植株发育减缓、生长势下降、品质变劣、枯萎病大量发生等连作障碍现象[1]，其中枯萎病被认为是引起西瓜连作障碍的最主要诱因，该病由尖抱镰刀菌西瓜专化型Fusarium oxysporum fsp.niveum，FON引起[2-3]，可造成西瓜大面积减产，甚至绝收，严重影响西瓜产业的发展。【前人研究进展】国内外学者开展了连作条件下抗病品种、嫁接栽培、土壤消毒以及生物防治等一系列研究，取得一定成效[4-9]。其中，生防菌剂防治是利用微生物生命活动的过程和产物来改善植株营养条件，刺激生长发育，抵抗病菌危害的一种防治措施，对人畜无害，对环境友好，不改变西瓜本身的风味，不会使病原菌产生抗性，近年来逐渐受到人们的重视[10-11]。生防微生物包括细菌、真菌、放线菌，其中生防细菌因为具有繁殖速度快、营养要求简单、环境适应性好和根际土壤定殖能力强等优点，成为植物病害生防研究和应用的热点[12-14]。【本研究切入点】目前已成功应用于植物病害防治的生防细菌主要来自芽孢杆菌属Bacillus和假单胞菌属Pseudomonas，其中以芽孢杆菌属细菌作为生防因子的研究最为广泛[15]，如南京农业大学研制的B系列生物农药[16]菜丰宁B1、菜丰宁BC2和宁盾系列生物农药[17]均是以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis为主要成份的生防菌剂。【拟解决的关键问题】解淀粉芽孢杆菌B1619 Baicllusamyloliquefaciens B1619是由江苏省农业科学院植物保护研究所以番茄枯萎病菌、青枯病菌为指示菌筛选获得的拮抗菌株，该拮抗菌对设施番茄枯萎病田间防效达到65.1%～85.2%，且对植株生长有较好的促生作用[18]。之后研究发现该生防菌株对其他作物土传病害也有一定防效。本试验在预试验的基础上，进一步研究了解淀粉芽孢杆菌B1619不同施用方式和施用剂量对西瓜土传枯萎病的防治效果，从而筛选出最优施用方案，为连作西瓜枯萎病防治提供新的解决路径和理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试品种 供试西瓜品种迁丽1号，由江苏省农业科学院宿迁农科所提供。
1.1.2 供试菌剂 解淀粉芽孢杆菌B1619由江苏省农业科学院植物保护研究所分离、鉴定，发明专利号ZL201210208366.9，中国微生物菌种保藏中心登记入册编号4671。供试菌剂解淀粉芽胞杆菌B1619水分散粒剂（含菌量为1.2×108cfu·g-1）由江苏省苏科农化有限公司提供。
1.1.3 供试土壤 试验在宿迁市运河湾自然农园西瓜试验基地进行。试验设施为钢架大棚，土质为沙壤土。该试验田已连作西瓜4年，2013年第一次种植，西瓜枯萎病无发生，2014-2016年发病率逐年上升，使用化学药剂防治，2016年发病率超过60%。2017年检测该试验土壤基本性状，枯萎病发病较重，土壤基本性状为有机质21.5 gkg-1，全氮2.2g·kg-1，碱解氮134.1mg·kg-1，速效磷30.8mg·kg-1，速效钾230.6mg·kg-1。
1.2 试验设计
1.2.1 栽培方式 试验西瓜田基肥施用优质腐熟有机肥22500kg·hm-2，45%硫酸钾型复合肥Z450kg·hm-2;追肥施用45%硫酸钾型复合肥225kg·hm-2。采用早春三膜覆盖方式种植，于2月上旬穴盘育苗，3月上旬移栽，5月中下旬采收。
1.2.2 试验处理 试验分别于西瓜移栽期和栽后第20 d使用供试药剂，设置了两种施用方法、3种不同浓度，即T1灌根（12g·穴-1+9g·穴-1，兑水灌根）、T2灌根（18g·穴-1+9g·穴-1，兑水灌根）、T3灌根（24g·穴-1+9g·穴-1，兑水灌根）、T1穴施（12g·穴-1+9g·穴-1，穴施后滴灌）、T2穴施（18g·穴-1+9g·穴-1，穴施后滴灌）、T3穴施（24g·穴-1+9g·穴-1，穴施后滴灌）、CK空白对照7个处理。每小区面积36m2，栽种西瓜40株，株距30cm：每处理3个重复，随机区组排列;小区间设保护行3株，棚头保护行20株。
1.3 测试指标与方法
1.3.1 西瓜植株生长发育及产量、品质调查 分别于西瓜移栽后第20d伸蔓期、第35d开花期、第50d果实膨大期，测定植株主蔓长度、主茎粗、叶面积、主蔓叶片数、叶片SPAD值、植株鲜重（除果实），植株鲜重在105℃下杀青，80℃下烘至恒重后测定植株干重。叶面积于伸蔓期测定植株第五张真叶，开花和成熟期分别测定开花节位和坐果节位叶片，叶面积=叶长×叶宽×0.7（校正系数）。叶片SPAD值定位叶片与上同。于西瓜移栽后第65d测定单瓜重、小区产量、中心乃立缘可溶性固形物含量及商品率等指标。
1.3.2 土壤微生物及西瓜枯萎病菌數量调查 分别于西瓜移栽后第35d开花期、第65d成熟期采集土壤样品。方法是各处理分别连续取5株植株根际20cm耕层土壤，立即过1mm筛，置于低温保温箱中带回实验室，暂存于-4℃冰箱用于土壤微生物数量调查。采用稀释平板法测定土壤微生物数量。土壤细菌数量测定采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌数量测定采用马丁氏培养基，放线菌数量测定采用改良高氏一号培养基[19]，尖孢镰刀菌数量采用Komada[20]的选择性培养基。
1.3.3 西瓜枯萎病发病情况调查分别于西瓜移栽后第50d坐果中期、第65d成熟期调查各处理西瓜发病情况。西瓜植株枯萎病的病情级数与病症参照表1标准分级，病情指数和防治效果按以下公式计算：
病情指数=∑（各级发病株数×病情级数）/（调查总株数×最高级数）×100
1.3.4 解淀粉芽胞杆菌B1619水分散粒剂不同施药量、不同施药方式防治效果比较根据各处理西瓜枯萎病发病情况调查结果，计算供试药剂不同施药量、不同施药方式防治效果。防治效果/%=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100。
1.4 分析方法
本试验数据用Microsoft Excel 2003进行计算，用SPSS20.0软件Duncans新复极差法进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 解淀粉芽胞杆菌B1619对连作西瓜生长发育的影响
试验结果发现，如表2所示，解淀粉芽孢杆菌B1619不同处理对连作西瓜生长的促进作用强弱差异较大，与施用方式和使用剂量紧密相关。灌根处理中，T2灌根效果最好，T3灌根次之，T1灌根与CK无显著差异。伸蔓期T2灌根主蔓长、茎粗、叶片数较CK分别增加了22.9%、17.0%、19.2%。T3灌根在移栽初期植株生长受到轻微抑制，伸蔓期逐步恢复。T2穴施和T3穴施在各处理中表现最好，两者间无显著差异。伸蔓期T2穴施主蔓长、茎粗、叶片数分别较CK增加了37.5%、24.5%、27.3%。试验结果说明，在相同剂量条件下穴施处理各个时期的生长指标均显著优于灌根处理。
2.2 解淀粉芽胞杆菌B1619对连作西瓜产量和品质的影响
成熟期调查（表3）发现，解淀粉芽孢杆菌B1619相同使用剂量下，灌根处理和穴施处理对西瓜产量和品质的影响差异显著，穴施处理效果明显优于灌根处理。穴施处理中T3穴施和T2穴施表现最好，二者差异不显著（P>0.05），折合每公顷产量分别达到36.96t和36.30t，增产率均超过40%，中心糖度也分别达到11.18%和11.22%，较对照9.30%显著提高。灌根处理中T2灌根表现最好，但增产率也仅为17.87%，中心糖度仅提高了1.54%。总体而言，T2穴施和T3穴施处理显著提高了连作西瓜的产量和品质，商品率从对照的29.82%提高到了70%以上。2.3解淀粉芽胞杆菌B1619对西瓜枯萎病的防治效果
解淀粉芽孢杆菌B1619不同的施用剂量和方式防治效果差异很大（表4）。本试验结果显示，连作西瓜坐果中期B1619处理均未发病，仅对照处理发病，发病率10.07%;成熟期各处理均出现病症，病情指数由高到低依次为T1灌根>T1穴施、T3灌根、T2灌根>T2穴施、T3穴施>CK。灌根处理和穴施处理的最佳防效分别是49.67%和68.21%，相同剂量下穴施的防治效果显著优于灌根。
2.4 解淀粉芽胞杆菌B1619对连作西瓜根际土壤微生物数量及尖孢镰刀菌数量的影响
试验比较分析了解淀粉芽孢杆菌B1619（T2穴施，下同）对连作西瓜根际可培养土壤微生物数量的影响。从图1～4可以看出：（1）B1619处理显著提高了连作西瓜根际土壤细菌数量。B1619开花期、成熟期根际土壤细菌数量分别是对照的1.93倍和1.27倍。两个处理细菌数量均为成熟期低于开花期，但B1619处理降低幅度较大，成熟期仅为开花期的55.56%。（2）两个处理真菌数量比较发现，B1619处理显著降低了连作西瓜根际土壤真菌数量，开花期和成熟期较对照分别降低了19.30%、12.55%。两个处理真菌数量均为成熟期高于开花期。（3）施用B1619有增加连作西瓜根际土壤放线菌数量的趋势，但增加幅度较小，差异不显著。成熟期两个处理放线菌数量均略低于开花期。（4）对病原菌尖孢镰刀菌的分离培养结果发现：B1619处理尖孢镰刀菌数量显著低于对照处理，开花期为5.33×102CFU·g-1，成熟期为8.00×102CFU·g-1，而对照开花期为7.33×102CFU·g-1，成熟期为11.67×102CFU·g-1。施用B1619有效控制了连作西瓜根际土壤尖抱镰刀菌数量的增加。
3 讨论与结论
解淀粉芽孢杆菌是一类重要的植物根际促生细菌，不仅对植物病害有较好的防治作用，还对植物的生长发育有一定的促进作用。Ryu等研究表明，土壤中解淀粉芽孢杆菌能够促进植物生长，增加植物产量和品质[21]。杨晓云等检测发现解淀粉芽孢杆菌B1619上清液中含有生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸和亚精胺等促生相关物质，对番茄种子萌发和幼苗生长具有显著促生作用[22]。本试验通过对不同生育时期西瓜生长相关指标进行调查，发现解淀粉芽孢杆菌B1619可以促进连作西瓜植株的生长，但促进效果与施用方式和剂量相关。灌根处理剂量较小（12g·穴-1+9g·穴-1）时，与对照无显著差异;剂量较大（24g·穴-1+9g·穴-1）时，移栽初期对植株生长产生明显的抑制作用，主要表现在植株变黄、生长变慢;剂量适中（18g·穴+9g·穴-1）时，西瓜生长前期促进作用显著，但后期作用效果减弱。相同剂量条件下，穴施处理对连作西瓜生长的促进作用显著优于灌根处理，效果随施用剂量的增加而增加。穴施18g·穴-1+9g·穴-1和24g·穴-1+9g·穴-1时，连作西瓜从生长前期到生长后期植株均表现出良好的长相，且在成熟期取得最优产量和品质。
吴勇等研究发现枯草芽胞杆菌BS303对西瓜枯萎病有很强的拮抗能力，能显著降低土壤中的病原菌数量[23];李成国等盆栽试验表明施用解淀粉芽孢杆菌L3能够有效降低西瓜根际的尖抱镰刀菌数量，较对照降低幅度达到50.4%[24]。针对解淀粉芽孢杆菌B1619的控病机理研究发现，B1619能在番茄根围、根表长时间定殖，占据生态位点，从而抑制番茄枯萎病菌的侵染[25];向亚萍等研究发现B1619菌株分泌的2种脂肽类抗生素对番茄枯萎病菌生长起到显著的抑制作用[26];施用B1619，盛果期根围土壤中枯萎病菌的數量可比对照下降达48%[27]。本试验中，穴施解淀粉芽孢杆菌B1619（18g·穴-1+9g·穴-1）可显著影响连作西瓜根际可培养微生物数量。细菌、放线菌数量较对照增加，真菌数量较对照降低，其中对细菌数量影响最为显著;同时西瓜枯萎病菌数量也得到降低，开花期和成熟期均较对照降低了30%以上。
微生物肥料的施用方式和使用剂量是微生物肥料进行广泛推广与使用的依据和基础。微生物肥料对植物的促生和抑病效果与其在根围的数量和培养条件直接相关[28]。本试验对西瓜枯萎病的发生情况监测发现，解淀粉芽孢杆菌B1619有效防控了连作西瓜枯萎病，以穴施18g·穴-1+9g·穴-1和24g·穴-1+9g·穴-1，效果最好，防效均超过65%，二者差异不显著（P>0.05）。因此，使用解淀粉芽孢杆菌B1619防控西瓜枯萎病时，建议使用穴施方式，本试验条件下剂量以18g+9g较为经济合理，不同连作年限和栽培环境可根据实际情况进行剂量调整。
参考文献：
[1]吴凤芝，赵凤艳，刘元英.设施蔬菜连作障碍原因综合分析与防治措施[J].东北农业大学学报，2000，31（3）：241-247.
[2]郭小敏.西瓜枯萎病菌和品种的遗传多样性研究[D].保定：河北农业大学，2004.
[3]吴洪生，周晓冬，李鹤，等.黄瓜、西瓜枯萎病拮抗细菌的初步分离与鉴定[J].西南农业学报，2013，26（3）：1019-1025.
[4]WU H S，GAO Z Q，ZHOU X D，et al.Microbial dynamics andnatural remediation patterns of Fusarium-infested watermelon soilunder 3-yr of continuous fallow condition[J].Soil Use andManagement，2013，29（2）：220-229.
[5]郝文雅，沈其荣，冉炜，等.西瓜和水稻根系分泌物中糖和氨基酸对西瓜枯萎病病原菌生长的影响[J].南京农业大学学报，2011，34（3）：77-82.
[6]KEINATH A P，HASSELL R L.Suppression of fusarium wilt causedby Fusarium oxysporum f sp.niveum race 2 on grafted triploidwatermelon[J].Plant Disease，2014，98（10）：1326-1332.
[7]沈宗专，孙莉，王东升，等.石灰碳铵熏蒸与施用生物有机肥对连作黄瓜和西瓜枯萎病及生物量的影响[J].应用生态学报，2017，28（10）：3351-3359.
[8]EVERTS K L，EGEL D S，LANGSTON D，et al.Chemicalmanagement of fusarium wilt of watermelon[J].Crop Protection，2014，66：114-119.
[9]曹云，宋修超，郭德杰，等.棉隆熏蒸与微生物有机肥联用对西瓜枯萎病的防控研究[J].土壤，2018，50（1）：93-100.
[10]吴石平，燕嗣皇，陆德清，等.木霉菌与三唑酮配合对西瓜生长的影响和对枯萎病的防效[J].西南农业学报，2002（2）：65-68.
[11]黎起秦，陈永宁，林纬，等.西瓜枯萎病生防细菌的筛选[J].广西农业生物科学，2000，19（2）：81-84.
[12]林先贵.土壤微生物研究原理与方法[M].北京：高等教育出版，2010.
[13]王卿.西瓜枯萎病生防细菌的筛选及作用机制初步研究[D].南京师范大学，2013.
[14]康金磊，韩旭，张仕琦，等.一株来源于筒篙根际的西瓜枯萎病拮抗菌的鉴定及特性研究[J].华北农学报，2016，31（S1）：447-452.
[15]胡亚杰，韦建玉，卢健，等.枯草芽孢杆菌在农作物生产上的应用研究进展[J].作物研究，2019，33（2）：167-172.
[16]丁中，刘跃，徐志荣，等.菜丰宁B1浓缩菌粉的防病机理、生产工艺及应用技术研究[J].农药，2000，39（8）：25-27.
[17]高彦林.微生物肥料“宁盾”大田示范推广研究[D].南京：南京农业大学，2015..
[18]王璐瑶，李兴东，段天凤，等.解淀粉芽胞杆菌B1619防控设施番茄枯萎病田间使用技术研究与示范[J].中国生物防治学报，2017，33（4）：512-518.
[19]赵斌，何绍江.微生物学实验[M].北京：科学出版社，2002.
[20]KOMADA H.Development of a selective medium for quantitativeisolation of Fusarium Oxyspomm from natural soil[J].Review ofPlant Protection Research，1975（8）：114-125.
[21]RYU C M，FARAG M A，HU C H，et al.Bacterial volatiles promotegrowth in Arabidopsis[J].Proceedings of the National Academy ofSciences，2003，100（8）：4927-4932.
[22]杨晓云，陈志谊，蒋盼盼，等.解淀粉芽孢杆菌B1619对番茄的促生作用[J].中国生物防治学报，2016，32（3）：349-356.
[23]吴勇，黄巧云，陈雯莉.低温生防菌枯草芽胞杆菌BS303的选育及其效果验证[J].华中农业大学学报，2017，36（3）：19-24.
[24]李成果.解淀粉芽孢杆菌L3对西瓜的防病促生作用研究[D].南京：南京农业大学，2016.
[25]乔俊卿，刘邮洲，夏彦飞，等.生防菌B1619在番茄根部的定殖及对根际微生态的影响[J].植物保护学报，2013，40（6）：507-511.
[26]向亚萍，周华飞，刘永锋，等.解淀粉芽孢杆菌B1619脂肽类抗生素的分离鉴定及其对番茄枯萎病菌的抵制作用[J].中国农业科学，2016，49（15）：2935-2944.
[27]张斌，杨晓云，刘邮洲，等.江苏省3个番茄种植基地枯萎病菌种群数量监测及生防菌B1619的控病效果[J].西南农业学报，2015，28（6）：2521-2526.
[28]BLOM D，FABBRI C，CONNOR E C，et al.Production of plantgrowth modulating volatiles is widespread among rhizosphere bacteriaand strongly depends on culture conditions[J].Environmentalmicrobiologl，2011，13（11）：3047-3058.
（责任编辑：林海清）
收稿日期：2019-07-24初稿;2019-10-OS修改稿
作者简介：王夏雯（1982-），女，硕士，副研究员，研究方向：西瓜新品种选育及连作障碍消减技术研究（E-mail：xiawen77@163.com）
通信作者：余翔（1983-），男，硕士，副研究员，研究方向：西瓜新品种选育与栽培技术研究（E-mail：yx003@163.com）
基金項目：宿迁市农业科技自主创新资金项目（SQCX201801）;宿迁市科技支撑计划项目（L201711）
