白藜芦醇联合奥沙利铂对人结肠癌细胞恶性生物学行为的抑制作用及机制

赵桂柱 孙占军 温志鹏

摘要 目的：探讨白藜芦醇（Res）联合奥沙利铂（Oxa）对人结肠癌细胞恶性生物学行为的抑制作用及机制。方法：将体外培养结肠癌HCT-116细胞分为Res组、Oxa组、联合组及对照组，分别以100 μmoL/L Res、2 μmoL/LOxa、100 μmoL/L Res+2 μmoL/LOxa、等量生理盐水处理，各组分别处理24、36、48 h。采用噻唑藍（MTT）法检测结肠癌HCT-116细胞增殖抑制情况;采用Transwell小室实验检测结肠癌HCT-116细胞侵袭能力;Wound Healing法检测结肠癌HCT-116细胞迁移能力;采用蛋白免疫印迹法检测结肠癌HCT-116细胞波形蛋白（Vimentin）蛋白表达情况。结果：干预48 h时，Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞增殖抑制率分别为（28.41±6.25）%、（36.11±8.47）%、（83.61±12.72）%;干预48 h时，对照组、Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞侵袭率分别（97.14±2.81）%、（81.23±4.52）%、（69.84±3.97）%、（37.11±3.58）%;迁移率分别为（68.57±4.02）%、（46.11±3.13）%、（31.25±2.86）%、（18.79±2.21）%;Vimentin蛋白相对表达量分别为0.93±0.14、0.52±0.08、0.31±0.04、0.13±0.02。Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞增殖抑制率呈逐渐升高趋势（P<0.05）;与对照组比较，Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞侵袭率、迁移率和Vimentin蛋白相对表达量降低，且联合组显著低于Res组与Oxa组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：Res与Oxa联合使用具有显著的协同效应，可更有效抑制结肠癌HCT-116细胞增殖，并降低其侵袭和迁移能力，其机制可能与下调Vimentin蛋白表达有关。

关键词 结肠癌;白藜芦醇;奥沙利铂;增殖;侵袭;迁移;波形蛋白;抗肿瘤;上皮细胞-间充质转化

Inhibitory Effect and Mechanism of Resveratrol Combined with Oxaliplatin on the Malignant Biological Behavior of Human Colon Cancer Cells

Zhao Guizhu， Sun Zhanjun， Wen Zhipeng

（Department of Pharmacy， Baogang Hospital， Baotou 014010， China）

Abstract Objective：To investigate the inhibitory effect and mechanism of resveratrol（Res）combined with oxaliplatin（Oxa）on the malignant biological behavior of human colon cancer cells.Methods：Colon cancer HCT-116 cells were cultured in vitro.The Res group， the Oxa group， the combination group and the control group were treated with 100 μmoL/L Res， 2 μmoL/L Oxa and 100 μmoL/L Res+2 μmoL/L Oxa， the same amount of saline， and each group was treated for 24， 36， 48 h.The inhibition of proliferation of colon cancer HCT-116 cells was detected by MTT assay; Transwell chamber assay was used to detect the invasion ability of colon cancer HCT-116 cells; Wound healing method was used to detect the migration ability of colon cancer HCT-116 cells; The expression of Vimentin protein（vimentin）in colon cancer HCT-116 cells was detected by Western blotting（Wb）method.Results：At 48 h after intervention， the proliferation inhibition rates of HCT-116 cells in the Res group， the Oxa group and the combination group were（28.41±6.25），（36.11±8.47）and（83.61±12.72）%， respectively; At 48 h after intervention， the invasive rates of HCT-116 cells in the control group， the Res group， the Oxa group and the combination group were（97.14±2.81），（81.23±4.52），（69.84±3.97），（37.11±3.58）%， respectively; The mobility rates were（68.57±4.02），（46.11±3.13），（31.25±2.86）， and（18.79±2.21）%， respectively; The relative expression levels of Vimentin protein were（0.93±0.14），（0.52±0.08），（0.31±0.04）， and（0.13±0.02）， respectively.The proliferation inhibition rate of colon cancer HCT-116 cells in the Res group， the Oxa group and the combination group increased gradually（P<0.05）; Compared with the control group， the invasion rate， mobility rate and Vimentin protein expression of HCT-116 cells in the Res group， the Oxa group and the combination group significantly decreased， and the combination group was significantly lower than the Res group and the Oxa group（all P<0.05）.Conclusion：The combination of Res and Oxa has significant synergistic effect， which can inhibit the proliferation of colon cancer HCT-116 cells and reduce its invasion and migration rate， and its mechanism may be related to the down-regulation of Vimentin protein expression.

Key Words Colon cancer; Resveratrol; Oxaliplatin; Proliferation; Invasion; Migrate; Vimentin; Antitumor; Epithelial-mesenchymal transition

中图分类号：R284;R735.3文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.022

奥沙利铂（Oxa）是继顺铂和卡铂之后的第三代铂类抗癌药物，具有较好的抗肿瘤效果，且目前已成为临床治疗胃癌及结直肠癌的一线化疗药物，白藜芦醇（Res）具有抗肿瘤、抗衰老、抗炎、抗氧化及抗血栓等多种药理学作用，已有研究证实，Res可对人乳腺癌、肝癌、胃癌、白血病等多种肿瘤细胞拮抗作用[1]。研究报道，Oxa和Res联用具有协同抑制结直肠癌细胞增殖的作用，其机制与抑癌基因miR-34c表达上调有关[2]。研究发现，Res能逆转人大肠癌细胞对Oxa耐药，进而抑制人大肠癌细胞增殖，诱导其凋亡[3]。本研究旨在探讨Res联合Oxa对人结肠癌细胞恶性生物学行为的抑制作用及机制，为临床治疗结肠癌提供指导。现报道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 结肠癌HCT-116细胞，购自南京凯基生物公司。

1.1.2 药物 Res（美国Sigma公司，批号：AM569872），规格：5 g，纯度>99%;Oxa（长沙华美医药科技开发有限公司，批号：201845683），规格：50 mg。

1.1.3 试剂与仪器 主要试剂：胎牛血清、DMEM培养基（美国Gibco公司，型号：CQ-80L）;噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司，型号：298-93-1）;Matrigel胶（美国BD公司，型号：40234A）;兔抗人Vimentin多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，型号：AZ050）等。主要仪器：CO2培养箱（英国RS Biotech公司，型号：GALAXYS）;超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，型号：SW-CJ-1FD）;小室（美国Corning公司，型号：Transwell）;光学倒置显微镜（日本OLympus公司，型号：CKX41）;蛋白垂直电泳仪（上海能科技有限公司，型号：VE-180）;全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司，型号：606型）;Image Pro Plus软件（美国Media Cybernetics公司，型号：Image Pro Plus）;图像分析软件（德国Leica公司，型号：Leica QWin）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

将结肠癌HCT-116细胞分为Res组、Oxa组、联合组及对照组。用含10%胎牛血清、100 U/mL青、链霉素的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养结肠癌HCT-116细胞[4]，取对数期结肠癌HCT-116细胞，接种于96孔板中。

1.2.2 给药方法

Res组、Oxa组、联合组及对照组分别以100 μmoL/L Res、2 μmoL/LOxa、100 μmoL/L Res+2 μmoL/LOxa、等量生理盐水处理，20 μL/孔，各组分别处理24、36、48 h。

1.2.3 检测指标与方法

MTT法检测结肠癌HCT-116细胞增殖抑制情况：细胞分组及处理同1.2.1，分别于干预24、36、48 h后，加MTT（5 mg/mL）溶液20 μL，孵育4 h，并设置8复孔，且各组均重复3次[5]。于570 nm波长处检测各孔吸光度值OD570 nm。结肠癌HCT-116细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD570 nm/对照组OD570 nm）×100%。

Transwell小室实验检测结肠癌HCT-116细胞侵袭力：于Transwell小室上室铺Matrigel基质胶50 μL，加无血清DMEM培养基，平衡12 h;胰酶消化，离心，1 500 r/min，5 min，收集对数期结肠癌HCT-116细胞，无血清培养基悬浮细胞，500 μL/室[6]。于下室置含10%胎牛血清的DMEM培养基，干预48 h时，棉签去除上室上的细胞，0.5%结晶紫染色。于光学倒置显微镜下观察并计数侵袭细胞数量。侵袭率（%）=下室细胞数量/细胞总数量×100%。

Wound Healing法检测结肠癌HCT-116细胞迁移能力：将对数期细胞调整浓度为5×105个/mL，接种于6孔板中。以200 μL无菌移液器枪头垂直于单层细胞划痕，划痕面积约10 mm×1 mm。各孔加含0.1%胎牛血清的培养基。由于结肠癌HCT-116细胞具有迁移能力，继续培养划痕会逐步融合，分别于干预0、24、36、48 h时在光学倒置显微镜下观察[7]，以Image Pro Plus软件计算划痕愈合率（%）=（0 h时划痕宽度-24/36/48 h时划痕宽度）/0 h时划痕宽度×100%。

蛋白免疫印迹法检测结肠癌HCT-116细胞Vimentin蛋白表达情况：细胞分组及处理同2.1，收集各组干预48 h时的细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取50 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以β-actin为内参，经Leica QWin图像分析软件进行分析结肠癌HCT-116细胞Vimentin蛋白相对表达情况[8]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验;多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间点结肠癌HCT-116细胞增殖抑制情况

各组结肠癌HCT-116细胞增殖抑制率均随时间延长而逐渐升高，且联合组显著高于Res组、Oxa组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 各组干预48 h后结肠癌HCT-116细胞侵袭能力比较

干预48 h，对照组、Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞侵袭率分别为（97.14±2.81）%、（81.23±4.52）%、（69.84±3.97）%、（37.11±3.58）%。与对照组比较，Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞侵袭率均显著降低，且联合组显著低于Res组、Oxa组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.3 各组干预后结肠癌HCT-116细胞迁移能力比较

干预24 h时，对照组、Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞迁移率分别为（18.41±2.16）%、（6.57±0.54）%、（3.12±0.29）%、（1.24±0.11）%;干预36 h时，各组迁移率分别为（37.39±3.22）%、（18.54±2.23）%、（14.11±1.78）%、（2.33±0.25）%;干预48 h时，各组迁移率分别为（68.57±4.02）%、（46.11±3.13）%、（31.25±2.86）%、（18.79±2.21）%。随干预时间延长，各组结肠癌HCT-116细胞迁移率逐渐升高;与对照组比较，Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞迁移率均显著降低，且联合组顯著低于Res组与Oxa组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

2.4 各组干预48 h后结肠癌HCT-116细胞Vimentin蛋白表达情况

干预48 h，对照组、Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞Vimentin蛋白相对表达量分别为（0.93±0.14），（0.52±0.08），（0.31±0.04），（0.13±0.02）。与对照组比较，Res组、Oxa组及联合组Vimentin蛋白相对表达量显著降低，且联合组显著低于Res组、Oxa组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

3 讨论

Oxa以DNA为作用靶点，通过形成铂化DNA化合物而抑制DNA的合成，并抑制DNA的修复，从而激活信号传导通路引起细胞死亡，发挥抗肿瘤的作用。Res又名茋三酚，是一种天然多酚类的植物抗毒素。研究显示，Res除具有抗炎、抗氧化、保护神经系统、调节骨代谢及雌激素等多种药理学作用外，还可通过抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡，抑制癌基因表达及干预信号转录等发挥抗肿瘤作用[9]。研究报道，Oxa可抑制人结肠癌SW620细胞增殖，其机制可能与抑制SW620细胞内源性核因子-κB、信号传导与转录激活因子3（STAT3）表达有关[10]。高俊英等[11]研究发现，Res可通过影响上皮细胞-间充质转化（EMT）过程、调控micro RNAs家族的表达来影响上皮肿瘤细胞的侵袭和迁移，提示Res可通过抑制肿瘤细胞的侵袭迁移控制肿瘤的发展。也有研究表明，Res可显著抑制胰腺癌Miapaca-2细胞的侵袭转移，且其抑制能力与药物浓度正相关[12]。本研究结果显示，联合组结肠癌HCT-116细胞增殖抑制率显著高于Res组、Oxa组，与对照组比较，Res组、Oxa组及联合组结肠癌HCT-116细胞侵袭及迁移率均显著降低，且联合组显著优于Res组与Oxa组，提示Res可抑制结肠癌HCT-116细胞增殖，降低其侵袭和迁移能力，且Res与Oxa联用具有显著的协同效应。EMT过程与肿瘤细胞侵袭、转移等密切相关。研究发现，三氧化二砷和Res联合使用可有效抑制肺癌细胞人侵袭、迁移，可能与下调Vimentin水平，抑制细胞基质的降解和EMT过程有关[13]。臧春宝等[14]研究发现，Res可调控EMT蛋白表达，下调Vimentin蛋白表达水平，抑制EMT，进而降低食管癌细胞的侵袭、迁移，提示Res可通过抑制EMT发生，控制肿瘤细胞的侵袭和迁移。本研究结果显示，Res组、Oxa组及联合组Vimentin蛋白相对表达量显著低于对照组，且联合组显著低于Res组、Oxa组，提示Res可下调Vimentin蛋白的表达，进而发挥抗肿瘤的作用。

综上所述，Res能明显抑制结肠癌HCT-116细胞增殖，同时降低其侵袭、迁移和Vimentin蛋白表达，与Oxa联用，可增强抗肿瘤作用，为临床治疗结肠癌提供了新思路。

参考文献

[1]Carter LG，D′Orazio JA，Pearson KJ.Resveratrol and cancer：focus on in vivo evidence[J].Endocr Relat Cancer，2014，21（3）：R209-225.

[2]常环环，杨姝，李文帅，等.白藜芦醇与奥沙利铂联合应用抑制结直肠癌细胞增殖的机制[J].解剖学杂志，2017，40（2）：125-128，136.

[3]王子元，孙筱婷，吴丽莉，等.白藜芦醇对人大肠癌耐药细胞增殖及凋亡的影响[J].上海中医药大学学报，2017，4（3）：55-60.

[4]赵绿翠，廖科，李科琼，等.吴茱萸碱调控人结肠癌HCT 116细胞中JAK2/STAT3信号通路的机制研究[J].中国药理学通报，2015，14（10）：1394-1398.

[5]张喆，陈信义，郑智.复方浙贝颗粒药物血清对人结肠癌HCT-116细胞增殖与凋亡的影响[J].中医杂志，2015，56（1）：55-58.

[6]杨柳婷，姜蓬垒，祖丹丹，等.NK4基因联合奥沙利铂对人结肠癌细胞株HCT116凋亡和侵袭的影响[J].中国癌症防治杂志，2017，9（6）：456-461.

[7]诸葛春凤，刘诗权，谭林，等.SphK1和FAK对人结肠癌HCT116细胞上皮间质转化的影响[J].中国病理生理杂志，2016，32（3）：439-444.

[8]Kurokawa K，Akaike Y，Masuda K，et al.Downregulation of serine/arginine-rich splicing factor 3 induces G1 cell cycle arrest and apoptosis in colon cancer cells[J].Oncogene，2014，33（11）：1407-1417.

[9]孙菁，王世卉.白藜芦醇对刀豆素A诱导小鼠自身免疫性肝炎的保护作用[J].贵州医科大学学报，2018，43（7）：768-774.

[10]林昌荣，杨建荣，李碧锦，等.奥沙利铂对人结肠癌细胞NF-κB、STAT3表达影响[J].中国公共卫生，2015，31（8）：1053-1055.

[11]高俊英，季淑华，郑兆娣，等.白藜芦醇抑制上皮肿瘤细胞侵袭和迁移的机制[J].生命科学，2018，30（7）：752-757.

[12]秦勇，马清涌，党晓燕，等.白藜芦醇对胰腺癌Miapaca-2细胞侵袭转移能力影响的体外观察[J].西安交通大学学报：医学版，2014，35（1）：64-68.

[13]郭天利，李宏健，庞慧，等.三氧化二砷联合白藜芦醇对肺癌细胞侵袭、迁移的影响及机制[J].中国老年学杂志，2018，38（12）：2972-2974.

[14]臧春宝，刘云琴，葛宁，等.白藜芦醇对食管鳞癌Eca-109细胞侵袭迁移及EMT的影响[J].蚌埠医学院学报，2015，40（12）：1617-1620，1623.

（2019-09-27收稿 责任编辑：杨觉雄）