电针对神经根型颈椎病大鼠PI3K/AKT信号通路的影响

段晓英 丁宏 曹振强 李艳双 王明礼

摘要 目的：觀察探讨电针对神经根颈椎病（CSR）大鼠PI3K/AKT信号转导通路及细胞凋亡的变化。方法：SD大鼠60只，按照随机数字表法分为空白组、模型组和电针组3组，每组20只。造模后第3天开始电针，取双侧颈夹脊穴，以一侧穴位为一组，两侧均通过针柄接电针治疗仪，疏密波，频率，强度以大鼠四肢轻度抖动为度。1次/d，30 min/次，连续治疗14 d后处死。采用YLS-3E型痛分析仪检测大鼠外周神经模型感觉功能，采用蛋白免疫印迹法检测PI3K/AKT通路表达情况，采用免疫组化法检测BAX和BCL-2，同时以DNA断裂的原位末端标记法（Tunel法）检测细胞凋亡情况。结果：1）与空白组比较，模型组和电针组大鼠外周神经疼痛感觉功能机械痛阈值均下降（P<0.05），其中电针组的机械痛阈值较模型组高（P<0.05）。2）与空白组比较，模型组和电针组大鼠PI3K、p-AKT的蛋白表达均下调（P<0.05），电针组PI3K、p-AKT较模型组明显上调（P<0.05），而3组的AKT和GAPDH蛋白表达差异均无统计学意义（P>0.05）。3）与空白组比较，电针组和模型组BAX明显上调（P<0.05），BCL-2则明显下调（P<0.05）;而电针组BAX表达程度低于模型组（P<0.05），电针组BCL-2的表达程度高于模型组（P<0.05）。4）与空白组比较，模型组和电针组细胞调亡比例均增高，差异有统计学意义（P<0.05）;电针组细胞调亡比例低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：电针双侧颈夹脊穴对CSR大鼠具有明显的镇痛作用，其机制可能与激活PI3K/AKT通路，激活下游BAX、BCL-2等生物因子抗细胞凋亡有关。

关键词 电针;神经根型;颈椎病;大鼠;PI3K;AKT;信号通路;动物实验

Effects of Electroacupuncture on PI3K/AKT Signaling Pathway in Rats with Cervical Spondylotic Radiculopathy

Duan Xiaoying，Ding Hong，Cao Zhenqiang，Li Yanshuang，Wang Mingli

（The Second Hospital of Jilin University，Changchun 130041，China）

Abstract Objective：To observe the changes of PI3K/AKT signal transduction pathway and apoptosis in rats with cervical spondylotic radiculopathy（CSR）treated by electroacupuncture.Methods：A total of 60 SD rats，SPF grade，weighing（250±20）g，half male and half female，were randomly divided into 3 groups：a blank group，a model group and an electro-acupuncture group with 20 rats in each group.On the 3rd day after modeling，electro-acupuncture was started.Neck Jiaji（EX-B2）acupoints on both sides were taken.One side of the acupoints was used as a group.Both sides were connected with electro-acupuncture therapeutic apparatus by needle handle.The frequency of dilatational and the intensity was moderate to the slight shaking of the limbs of rats.Once a day，30 minutes each time，after 14 consecutive days of treatment，they were executed.The sensory function of rat peripheral nerve model was detected by YLS-3E pain analyzer.The expression of PI3K/AKT pathway was detected by protein immunoblotting.BAX and BCL-2 were detected by immunohistochemistry.Apoptosis was detected by in situ end labeling（Tunel）with DNA fragmentation.Results：1）Compared with the blank group，the mechanical pain threshold of peripheral nerve pain sensory function in model group and electro-acupuncture group decreased（P<0.05）.The mechanical pain threshold in electro-acupuncture group was higher than that in model group（P<0.05），suggesting that electro-acupuncture could effectively improve the peripheral nerve pain sensory function in CSR rats.2）Compared with the blank group，the expression of PI3K and p-AKT protein in the model group and electro-acupuncture group were down-regulated（P<0.05）.Among them，PI3K and p-AKT in the electro-acupuncture group were up-regulated significantly（P<0.05），while the expression of PI3K and p-AKT protein in the AKT and GAPDH groups were not significantly different（P>0.05），suggesting that electro-acupuncture CSR rats activated PI3K/AKT signal transduction pathway.3）Compared with the blank group，BAX increased significantly in EA group and model group（P<0.05），while BCL-2 decreased significantly（P<0.05）.BAX expression in EA group was lower than that in model group（P<0.05），and BCL-2 expression in EA group was higher than that in model group（P<0.05）.4）Compared with the blank group，the proportion of apoptotic cells in the model group and the electro-acupuncture group increased with statistical significance（P<0.05）; compared with the model group，the proportion of apoptotic cells in the electro-acupuncture group was lower than that in the model group，with statistical significance（P<0.05）.Conclusion：Electro-acupuncture at bilateral cervical Jiaji points has obvious analgesic effect on CSR rats.The mechanism may be related to activating PI3K/AKT pathway，activating downstream biological factors such as BAX，BCL-2 and so on to resist cell apoptosis.

Key Words Electroacupuncture; Nerve root type; Cervical spondylosis; Rats; PI3K; AKT; Signal pathway; Animal experiment

中图分类号：R246.9文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.020

神经根型颈椎病（Cervical Spondylosis Radiculopathy，CSR）的主要临床症状是颈部神经根性疼痛，病因主要是由于椎间盘退行性病变压迫或刺激神经根而出现一系列分子生物学反应造成的[1-3]，其中炎性反应递质是引起CSR根性疼痛的重要原因[4-5]。近期研究[6-7]表明，炎性反应主要与细胞内大量传导通路的参与有关，其中被广泛证实主要在细胞存活中起调控作用的是磷脂酰肌醇3-激酶/丝氧酸-苏氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信号通路。PI3K/AKT在哺乳动物中有3个亚型，其中Ⅲ型为调控细胞增殖和调亡的关键，通过肌醇环第3位点磷酸化底物，激活PI3K信号传导通路的关键下游靶点AKT。p-AKT由约480个氨基酸残基组成，包括PH、激酶催化和羟基端调控的3部分结构域，其中羟基端是疏水性的，在调节域的40个氨基酸序列中，含有非常重要的磷酸化位点丝氨酸473位点，这个位点的磷酸化是AKT完全活化的必要因素，当AKT被PDK2磷酸化为p-AKT后，PKB/AKT便具有了活性，而活化了的AKT通过磷酸化含有丝氨酸残基的底物（如BAX及BCL-2等）而产生抗凋亡的分子生物学效应。有研究[8-9]证实，PI3K/AKT转导途径与脊神经细胞调亡关系甚密，研究人员在大鼠脊神经细胞培养中加入PI3K抑制剂后发现细胞的凋亡细胞比率上升。因此，PI3K/AKT传导途径对脊神经细胞的凋亡意义重大。CSR属于中医学“项痹”，中医学常见的治疗方法有针灸、电针、推拿等。有研究[10-11]表明，单纯针刺双侧颈夹脊穴及电针双侧颈夹脊穴，均可缓解颈椎病颈痛患者的颈痛程度、提高日常生活活动能力;治疗后及随访后，观察组疗效均优于对照组。因此本研究采用电针双侧颈夹脊穴对CSR大鼠进行治疗，观察电针对CSR大鼠PI3K/AKT信号转导通路和细胞凋亡的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD大鼠60只，SPF级，体质量（250±20）g，雌雄各半，相同饲养环境下，相同批次的喂养饲料，密闭饲养，实验大鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物许可证号：SCXK（京）2016-0006]。饲养环境：温度（26±0.5）℃，湿度（50±2.5）%。

1.1.2 实验仪器与试剂 型痛分析仪（北京众实嘉合生物科技有限公司，型号：YLS-3E）检测;电针治疗仪（北京中西远大科技有限公司，型号：G-6805）;一次性使用无菌针灸针（规格0.35 mm×13 mm，华佗牌）;涡旋振荡仪（上海珂淮仪器有限公司，型号：I-4002-HCS）;蛋白电泳及转膜系统（Bio-Rad公司，型号：170-4070）;台式高速离心机（Eppendorf公司，型号：5810R）;抗体p-AKT（货号：4060T）、AKT（货号：4685S）、PI3K（货号：17366S）、BAX（货号：5023T）、BCL-2（货号：15071T）和GAPDH（货号：5174T），全部购于CST公司;SDS-PAGE琼脂糖凝胶（上海钰博生物科技有限公司，批号YB81218-30）;TUNEL检验试剂盒（美国Roche公司，批号11684795910）。

1.2 方法

1.2.1 分組与模型制备 SD大鼠60只，按随机数字表法分为空白组、模型组、电针组3组，每组20只。参照窦夏睿氏法[12]进行CSR动物造模，首先将大鼠用10%水合氯醛，按0.35 m/100 g剂量进行常规麻醉，俯卧位固定，首先手触下颈部附近定位最高棘突（T2），常规手术配皮和消毒后，于背部正中线由T2向上用手术剪快速做3 cm左右切口，用手术弯镊不破坏肌肉组织的前提下，逐层钝性分离颈后皮下组织和肌群，当充分暴露C6～T2左侧椎弓时，采用显微镊轻轻挑开4个椎体的3个椎间隙（C6和C7、C7和T1、T1和T2）的黄韧带和结缔组织，再以尖嘴蚊式钳轻轻钳开C7左侧椎弓，在充分暴露脊髓后，用神外显微剥离器之神经剥离子将脊髓轻推至右侧，再用显微外科镊将尼龙渔线（0.5 mm×15 mm，组织黏附性处理：尼龙渔线经过乙醇浸泡，无菌干燥后再浸泡至0.1%的多聚赖氨酸溶液中）轻轻沿脊髓纵轴放至C6-7、T1神经根腋下，动物造模中尤其需要注意插线时不要过度下压，以免碰破椎静脉丛导致椎管内大量出血。CSR造模完成后，逐层关闭伤口，病因手术针线进行缝合。

1.2.2 干预方法

1.2.2.1 空白组 正常饲养，不做任何处置。

1.2.2.2 模型组 于造模后第3天开始，每日抓取1次，不做针刺处置。

1.2.2.3 电针组 造模后第3天开始电针，取穴：参照大鼠穴位图谱[13]，取双侧颈夹脊穴，常规消毒穴区皮肤，直刺进针，进针深度0.3～0.5 cm，轻捻转提插后，以一侧穴位为1组，两侧均通过针柄接电针治疗仪，疏密波，频率，强度以大鼠四肢轻度抖动为度。1次/d，30 min/次，连续治疗14 d后处死。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 模型评价 参照文献[14]将造模后的大鼠每日固定时间段（9：00至10：30）置于观察箱，适应30 min后出现嘶叫、自叫等行为;同时参照Kawakami及Dubussion法评估大鼠步态障碍的方法：若出现受损伤足不持重或轻微持重、大鼠在行走时出现跛行;或受损足的大鼠走动时不着台面，伴有明显的足内收蜷缩畸形等现象说明造模成功。造模不成功的大鼠予以排除，不纳入后续研究。

1.2.3.2 外周神经模型感觉功能的检测 采用YLS-3E型痛分析仪检测大鼠外周神经模型感觉功能，在大鼠清醒状态下测量机械性痛阈，首先将YLS-3E型痛分析仪上一个钝头有机玻璃圆锥体此安装固定于大鼠足趾第3、4跖骨间，通过线性逐渐增大压力，直到大鼠嘶叫挣扎为止，此时仪器自动记录下的大鼠最后试图抽回后爪压力值（g）即为大鼠的机械痛阈，以此评估大鼠外周神经模型感觉功能。

1.2.3.3 蛋白质印迹法检测PI3K/AKT通路表达动物于造模电针干预14 d后，通过用10%水合氯醛过量麻醉致死，然后在4 ℃下将造模是C6-T2段压尼龙鱼线处脊髓及神经根剥离出来，并以用研磨器制成组织匀浆，在蛋白裂解液的作用下，充分提取蛋白后，在低温离心机上高速离心（12 000 r/min），取上清液，-20 ℃冰箱保留代用。然后以考马斯亮蓝法测定样品蛋白浓度，计算同等体积下，每组样品的蛋白上样量。取出所购买的SDS-PAGE琼脂糖凝胶，加入电泳液并没过短玻板，轻轻提取加样孔梳，在第一加样孔用移液器精密加入5 μL蛋白MARKER对蛋白分子量进行标记，其余加样孔根据空白组、模型组和电针组依次根据已得上样量进行加样。然后以60 V开始蛋白电泳待蛋白均跑出浓缩胶后，以100 V继续蛋白电泳至所有蛋白跑到底部停止，接着根据MARKER切出所检测蛋白的分子量，裁剪出相应大小的滤纸和PVDF膜，根据三明治转膜法，加入转膜液常规转膜，取出转好蛋白的PVDF膜时需及时标记正反面。之后将PVDF膜在5%脱脂牛奶中常规封闭1 h，分别加入PI3K、p-AKT、AKT和GAPDH一抗在4 ℃冰箱中孵育过夜，次日用TBST缓冲液室温摇床洗3次，10 min/次;加入对应二抗，摇床充分反应2 h后，用TBST缓冲液室温摇床洗3次，10 min/次;ECL显色试剂盒在避光黑暗处滴加在PVDF膜上，反应1 min后在CHEMIC成像仪上读取蛋白条达图像，并通过Image图像处理软件读取蛋白条带灰度值。

1.2.3.4 免疫组化法检测BAX、BCL-2的表达 动物于造模电针干预14 d后，通过用10%水合氯醛过量麻醉致死，然后在4 ℃下将造模是C6-T2段压尼龙鱼线处脊髓及神经根剥离出来放置于4%福尔马林中，48 h后进行常规组织脱水和透明处理，然后在二甲苯与石蜡混合液中进行渗透和常规石蜡包埋，采用美国旋转切片机连续切片4 μm厚度，每张切片均以防脱载玻片承载并于贴片后放置在60 ℃烤箱中烘烤5 h。常规脱蜡水化后，以枸橼酸缓冲液在微波炉中加热至沸腾，闭门焖5 min进行抗原修复，待冷却至室温后PBS泡洗后加封闭液封闭10 min，防水笔在切片周围画好隔离圈后，加入一抗BAX、BCL-24 ℃冰箱孵育过夜，次日于37 ℃烤箱中回温45 min，PBS泡洗3次，5 min/次，加入对应二抗，室温反应10 min，PBS泡洗3次，5 min/次，DAB显色后再浸泡于苏木素中复染30 s，常规脱水封片后在显微镜下观察，计数，拍片。

1.2.3.5 DNA断裂的原位末端标记法（Tunel法）检测细胞凋亡的情况 动物于造模电针干预14 d后，通过用10%水合氯醛过量麻醉致死，然后在4 ℃下将造模是C6-T2段压尼龙鱼线处脊髓及神经根剥离出来，同1.2.3.4免疫组化常规石蜡包埋，切片，脱蜡水化后，加入现配的3%H2O2，室温孵育10 min后，蒸馏水浸泡洗3遍，每遍2 min;然后加入0.01MTBS和新鲜稀释蛋白酶K混合液（1∶200）15 min，0.01MTBS浸泡洗3遍，每遍2 min;接著切片分别加入20 μL添加标记液（1 μL TDT、1 μL DIG-UTP和18 μL标记缓冲液）37 ℃孵育2 h，0.01MTBS浸泡洗3遍，每遍2 min;封闭液封闭30 min，1%DGX抗体溶液反应30 min，0.01MTBS浸泡洗3遍，每遍2 min;1%SBAC溶液反应30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察，计数，拍片。各组切片光镜下随机拍摄7个高倍视野，每个视野计数100个细胞计算细胞调亡率调亡率（%）=[（调亡细胞数/总细胞数）]×100%。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，3组数据同时符合正态分布和方差齐性，采用单因素方差分析，若其中一组数据不符合正态分布，则采用多组秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组CSR造模成功率 根据造模模型评价标准，模型组和电针组分别有18只和17只大鼠的CSR造模成功，纳入后续研究。见图1。

2.2 电针对CSR大鼠外周神经疼痛感觉功能的影响 与空白组比较，模型组和电针组大鼠外周神经疼痛感觉功能机械痛阈值均下降（P<0.05），其中电针组机械痛阈值较模型组高（P<0.05），提示电针能有效改善CSR大鼠外周神经疼痛感觉功能。见表1。

2.3 电针对PI3K/AKT通路的影响 与空白组比较，模型组和电针组大鼠PI3K、p-AKT的蛋白表达均下调（P<0.05），其中电针组的PI3K、p-AKT较模型组明显上调（P<0.05），而3组的AKT和GAPDH蛋白表达差异均无统计学意义（P>0.05），提示电针CSR大鼠能激活PI3K/AKT信号转导通路。见图2。

2.4 电针对BAX和BCL-2的影响 与空白组比较，电针组和模型组BAX明显上调（P<0.05），而BCL-2则明显下调（P<0.05）;而电针组BAX表达程度低于模型组（P<0.05），电针组中BCL-2的表达程度高于模型组（P<0.05）。见图3和表2。

2.5 各组TUNEL的表达情况 与空白组比较，模型组和电针组细胞调亡比例均增高，差异有统计学意义（P<0.05）;电针组与模型组比较，细胞调亡比例低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4。

3 讨论

颈椎病属于中医学“痹证”“项痹”等范畴。此病中医学病因多由劳损或风寒湿等邪气侵袭人体而诱发，引起颈项部疼痛或上肢麻木等气血运行不畅之表现，故也常称其为“项强”。颈椎病最根本的病因当属气虚血瘀型项痹，病位在肝肾，致病特点可概括为本虚标实。目前，在颈椎病的治疗方法中，中医疗法的针灸和推拿为首选。有研究人员采用电针颈夹脊穴治疗CSR取得总有效率的疗效更好，患者治疗后外周神经疼痛症状疗效明显优于治疗前;若配合辨证取穴治疗CSR，有效率达97%[15]。因此认为，电针治疗CSR疗效显著。在本实验中，电针的波形选择疏密波，缘于本研究团队在临床诊疗CSR中发现疏密波的抗炎止痛效果明显好于连续波和断续波，同时研究[16]发现，电针的2 Hz和100 Hz的频率分别能够促进脊髓释放不同阿片类物质起到镇痛效应，而疏密波是高低2种频率间歇使用，使脊髓能释放包括强啡肽在内的4种己知阿片类物质，相互叠加起到更强的镇痛消炎效果，可有效改善患者CSR的临床症状;另外，研究人员通过对不同波形电针对颈性疼痛疗效的观察，不仅证实了疏密波对颈椎病的疗效优于连续波，而且发现疏密波可保持机体对电针治疗的敏感度，防止耐受[17]。

PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，具有脂类激酶活性和蛋白激酶活性，可被受体酪氨酸激酶或G2蛋白耦联受体激活，再通过第二信使（如BAX和BCL-2）在细胞的增殖、调亡等过程中起重要的作用。BAX和BCL-2是PI3K/AKT信号转导通路上的2个关键因子，他们同属BCL-2家族，参与细胞调亡的重要生物学因子。其中BAX是促细胞凋亡的因子，而BCL-2则与之相反，属于抗细胞调亡的因子。现代研究表明，BCL-2家族主要是以线粒体为靶器官，通过对线粒体的介导而对细胞凋亡过程起调控作用。BCL-2家族可分为3个结构功能各异的亚家族：一是BAX亚族，可促进细胞凋亡;二是BCL-2亚族，起到抑制凋亡的作用;三是BH3域蛋白亚族，和BAX一样也是促进调亡发生的重要因子。BAX对细胞凋亡的调控可能通过诱发线粒体膜上供凋亡蛋白通过的离子通道开放和精确改变线粒体膜的通透性而释放CytC;而BCL-2则是通过拮抗BAX，抑制细胞色素C与半胱氨酸蛋白酶激活而起到的抗凋亡作用[18]。本研究结果显示：电针激活了PI3K/AKT通路，而BAX和BCL-2的免疫组化结果发现与空白组比较，电针组和模型组中BAX明显上调（P<0.05），而BCL-2则明显下调（P<0.05）;而电针组中BAX表达程度低于模型组（P<0.05），电针组中BCL-2的表达程度高于模型组（P<0.05）。提示电针治疗后激活PI3K/AKT通路，进而诱导下游BAX和BCL-2的分子生物学反应，其中通过下调BAX的表达和上调BCL-2的表达，从而起到对CSR的脊神经细胞的保护作用。

综上所述，本研究发现，电针双侧颈夹脊穴对CSR大鼠具有明显的镇痛作用，其机制可能与激活PI3K/AKT通路，下调下游BAX的表达和上调BCL-2的表达而起到抗脊神经细胞凋亡有关。

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（2018-12-12收稿 责任编辑：芮莉莉）