柱前衍生HPLC/FLD-APCI/MS法同时测定藏药悬钩木中6种三萜酸类成分的含量

马志良　赛桑杰　多杰

中圖分类号 R284.1;R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）16-2243-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.16

摘 要 目的：建立同时测定藏药悬钩木中山楂酸、科罗索酸、桦木酸、路路通酸、齐墩果酸、熊果酸等6种三萜酸类成分含量的方法。方法：采用柱前衍生高效液相色谱-荧光检测/质谱联用法。选择2-（7H-二苯并[a，g]咔唑）乙基对甲苯磺酸酯为荧光衍生化试剂。色谱柱为Hypersil C18，流动相为5%乙腈水溶液-乙腈（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，荧光激发波长为300 nm，发射波长为 395 nm，柱温为35 ℃，进样量为10 μL;采用大气压化学电离源、正离子模式，喷雾压力为60 psi，干燥气流量为9 L/min，干燥气温度为350 ℃，气化温度为450 ℃，毛细管电压为3 500 V。结果：山楂酸、科罗索酸、桦木酸、路路通酸、齐墩果酸、熊果酸检测质量浓度线性范围均为0.025～6.4 μg/mL（r≥0.999 6）;定量限分别为5.11、4.78、4.42、4.22、4.29、4.51 ng/mL，检测限分别为1.42、1.27、1.30、1.28、1.16、1.22 ng/mL;精密度试验的RSD 均小于5%，稳定性、重复性试验的RSD均小于2%（路路通酸未检出）;加样回收率分别为97.90%～100.55%（RSD=1.00%，n=6）、97.95%～102.95%（RSD=1.74%，n=6）、96.00%～101.20%（RSD=2.00%，n=6）、93.25%～104.20%（RSD=4.25%，n=6）、92.20%～103.30%（RSD=3.58%，n=6）、97.80%～103.50%（RSD=2.03%，n=6）。结论：该方法准确、可靠，专属性好，可用于同时测定藏药悬钩木中6种三萜酸类成分的含量。

关键词 悬钩木;三萜酸;山楂酸;科罗索酸;桦木酸;路路通酸;齐墩果酸;熊果酸;柱前衍生化;高效液相色谱-荧光检测/质谱联用;含量测定

Content Determination of 6 Kinds of Triterpene Acid in Tibetan Medicine Rubus biflorus by Pre-column Derivatization HPLC/FLD-APCI /MS

MA Zhiliang1，2，SAI Sangjie1，2，DUO Jie1，2（1. State Key Laboratory of Tibetan Medicine Research and Development/Qinghai Province Key Laboratory of Tibetan Medicine Research and Development， Xining 810016， China; 2. Qinghai Tibetan Medicine Research Institute， Xining 810016， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To establish the method for content determination of 6 kinds of triterpene acids such as haw acid， corosolic acid， betula acid， betulonic acid， oleanolic acid and ursolic acid in Tibetan medicine Rubus biflorus. METHODS： Pre-column devrivatization HPLC-FLD-APCI/MS method was adopted. 2-（7H-dibenzo[a，g]carbazol-7-yl） ethyl-4-methylbenzene- sulfonate was used as the pre-column derivatization reagent.Hypersil C18 column was used with the mobile phase consisted of 5% acetonitrile water solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The excitation wavelength of fluorescence was 300 nm and the emission wavelength was 395 nm. The column temperature was 35 ℃， and sample size was 10 μL. Under atmospheric-pressure chemical ionization （APCI） source in positive-ion mode， pressure was 60 psi， the drying gas flow rate was 9 L/min， the dry gas temperature was 350 ℃， the gasification temperature was 450 ℃， and the capillary voltage was 3 500 V. RESULTS： The linear range of haw acid，corosolic acid，betula acid，betulonic acid，oleanolic acid and ursolic acid were 0.025-6.4 μg/mL（r≥0.999 6）. The quantitative limits were 5.11， 4.78， 4.42， 4.22， 4.29， 4.51 ng/mL; and detection limits were 1.42， 1.27， 1.30， 1.28， 1.16， 1.22 ng/mL， respectively. RSD of precision test was less than 5%， stability and repeatability tests were all less than 2%（no betulonic acid detected）. The recovery rates were 97.90%-100.55%（RSD=1.00%，n=6）， 97.95%-102.95%（RSD=1.74%，n=6）， 96.00%-101.20%（RSD=2.00%，n=6）， 93.25%-104.20%（RSD=4.25%，n=6）， 92.20%-103.30%（RSD=3.58%，n=6）， 97.80%-103.50%（RSD=2.03%，n=6）， respectively. CONCLUSIONS： The method is accurate， reliable and exclusive， and can be used for simultaneous determination of 6 kinds of triterpene acids in Tibetan medicine R. biflorus.

KEYWORDS   Rubus biflorus; Triterpene acid; Haw acid; Corosolic acid; Betula acid; Betulonic acid; Oleanolic acid; Ursolic acid; Pre-column derivation; HPLC-FLD-APCI/MS; Content determination

藏药悬钩木收载于《医学四续》[1]、《月王药诊》[2]和《晶珠本草》[3]等典籍中，为常用藏药之一，藏文译音为“干扎嘎日”，为蔷薇科悬钩子属植物粉枝莓（Rubus biflorus Buch.-Ham. ex Smith）的干燥、去皮茎或枝，分布于我国陕西、甘肃、四川、青海、西藏等地[4-5]。《晶珠本草》中记载：“悬钩木根苦，茎微甘苦，皮微辛，叶苦涩，果实甜如蜜，根、茎、叶、果治隆热病和痰病，尤其对肺病特效，也治热性时疫，叶子可清胆病”[3]。有研究发现，悬钩木中含有多种生物活性成分，如黄酮类、二萜类、三萜及三萜酸类、鞣质类等成分[6-8]，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗过敏及保肝等作用[9-10]。三萜酸类成分为其特征成分，具有抗人类免疫缺陷病毒、抗肿瘤、降血脂、抗氧化和抗菌等作用[11-12]。然而，目前对于悬钩木的质量控制存在一定的局限性，如《藏药标准》中仅有其性状鉴别，未见有其他相关规定[13];《青海省藏药标准》中也未设有含量测定项或理化鉴别项[14]。因悬钩木中的三萜酸类成分不具有荧光性，采用衍生化可以使三萜酸类成分与衍生化试剂的荧光团结合，以提高检测灵敏度，故为更好地控制悬钩木的质量，本研究参考相关文献[15]，采用柱前衍生高效液相色谱-荧光检测/质谱联用法（HPLC/FLD- APCI/MS）同时测定了藏药悬钩木中山楂酸、科罗索酸、桦木酸、路路通酸、齐墩果酸、熊果酸等6种三萜酸类成分的含量，旨在为完善其质量标准提供参考。

1 材料

1.1 儀器

1100型离子阱液相色谱-质谱联用仪，包括G1311A型四元梯度泵、G1322A型在线真空脱气机、G1321A型荧光检测器、G1316A型自动进样器（美国Agilent公司）;MS204TS型、MS403TS型电子分析天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司];KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

齐墩果酸对照品（批号：110709-201808，纯度：91.1%）、熊果酸对照品（批号：110742-201823，纯度：99.9%）、路路通酸对照品（批号：111735-201602，纯度：96.8%）均购自中国食品药品检定研究院;山楂酸对照品（批号：4373-41-5，纯度：>98%）、科罗索酸对照品（批号：4547-24-4，纯度：>98%）、桦木酸对照品（批号：472-15-1，纯度：>98%）均购自北京万佳首化生物科技有限公司;2-（7H-二苯并[a，g]咔唑）乙基对甲苯磺酸酯（DBCETS，衍生化试剂，曲阜师范大学生命有机分析重点实验室自制）;乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯净水。

1.3 药材

悬钩木药材采自青海、甘肃和西藏等地（批号：20170801、20170802、20170803、20170804、20170805、20170806），经青海省藏医药研究院多杰研究员鉴定为蔷薇科植物粉枝莓（Rubus biflorus Buch.-Ham.ex Smith）。取药材将其根、茎、叶分离后晾干，分别粉碎后过40目筛，室温贮存，备用。

2 方法与结果

2.1 试验条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil C18（200 mm×4.6 mm，5 µm）;流动相：5%乙腈水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～15 min，60%B→75%B;15～30 min，75%B→90%B;30～35 min，90%B→100%B），洗脱时间40 min;流速：1.0 mL/min;荧光激发波长：300 nm，发射波长：395 nm;柱温：35 ℃;进样量：10 μL。在该色谱条件下，所有待测成分理论板数均不低于3 000，分离度均大于1.5，空白溶液对测定无干扰，详见图1。

2.1.2 质谱条件 大气压化学电离源（APCI），正离子模式;喷雾压力：60 psi;干燥气流量：9 L/min;干燥气温度：350 ℃;气化温度：450 ℃;毛细管电压：3 500 V。在该质谱条件下，三萜酸类成分（以齐墩果酸为例）衍生物的一、二级质谱图及相关裂解模式见图2。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取山楂酸、科罗索酸、桦木酸、路路通酸、齐墩果酸、熊果酸对照品各适量，分别置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，制成质量浓度均为2.0 mg/mL的单一对照品贮备液。分别精密吸取上述单一对照品贮备液各1 mL，置于100 mL量瓶中，加乙腈定容，摇匀，制得质量浓度均为20 µg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密称取药材样品（茎）40 mg，置于10 mL玻璃试管中，加乙醇5 mL，水浴超声（功率：200 W，频率：40 kHz）处理30 min，以3 000 r/min离心5 min;取下层残渣，加乙醇2 mL，水浴超声;合并2次超声提取液，置于10 mL玻璃试管中，氮气流下吹干后，加乙腈1 mL复溶，即得供试品溶液。

2.2.3 空白溶液 以乙腈为空白溶液。

2.2.4 衍生化试液 精密称取DBCETS 23.25 mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，制得浓度为5.0×10-3 mol/L的DBCETS溶液，于4 ℃保存，备用。

2.3 衍生化处理

取“2.2.1”项下混合对照品溶液50 µL，置于2 mL安瓿瓶中，加入干燥催化剂（K2CO3）30 mg、“2.2.4”项下衍生化试液150 µL、二甲基甲酰胺100 µL，封口后于90 ℃水浴反应30 min;待反应结束后，加乙腈300 µL稀释，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.1”项下试验条件进行测定。DBCETS与三萜酸类成分（以桦木酸为例）的衍生反应见图3。

2.4 线性关系考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，加乙腈稀释，制得质量浓度为0.025、0.1、0.4、1.6、6.4 μg/mL的系列线性关系工作溶液，按“2.3”项下方法进行衍生化处理，再按“2.1”项下试验条件进行测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，结果见表1。

2.5 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，用乙腈倍比稀释，按“2.3”项下方法进行衍生化处理，再按“2.1”项下试验条件进行测定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果，山楂酸、科罗索酸、桦木酸、路路通酸、齐墩果酸、熊果酸的定量限分别为5.11、4.78、4.42、4.22、4.29、4.51 ng/mL，检测限分别为1.42、1.27、1.30、1.28、1.16、1.22 ng/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.3”项下方法进行衍生化处理，再按“2.1”项下试验条件连续测定6次，记录峰面积。结果，山楂酸、科罗索酸、桦木酸、路路通酸、齐墩果酸、熊果酸峰面积的RSD分别为2.55%、3.20%、2.72%、4.30%、2.10%、3.30%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（莖，批号：20170801）适量，按“2.3”项下方法进行衍生化处理，分别于室温下放置0、3、6、9、12 h时按“2.1”项下试验条件进行测定，记录峰面积。结果，山楂酸、科罗索酸、桦木酸、齐墩果酸、熊果酸峰面积的RSD分别为1.48%、1.01%、1.43%、1.11%、1.72%（n=5），路路通酸未检出，表明供试品溶液于室温下放置12 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取药材样品（茎，批号：20170801）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下方法进行衍生化处理，再按“2.1”项下试验条件进行测定，记录峰面积并按外标法计算样品中6种成分的含量。结果，山楂酸、科罗索酸、桦木酸、齐墩果酸、熊果酸的平均含量分别为106.9、112.0、236.4、2 513.5、2 572.6 µg/g，RSD分别为 1.65%、1.59%、1.53%、1.22%、1.43%（n=6），路路通酸未检出，表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取药材样品（茎，批号：20170801）约0.04 g，共6份，分别加入一定量的混合对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下方法进行衍生化处理，再按“2.1”项下试验条件进行测定，记录峰面积并按外标法计算含量及加样回收率，结果见表2。

2.10 耐用性试验

取药材样品（茎，批号：20170801）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下方法进行衍生化处理，再按“2.1”项下试验条件[分别改变不同色谱柱（Agilent Hypersil C18、Agilent Hypersil BDS C8、Agilent Hypersil BDS C18）、流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）、柱温（30 、35、40 ℃）等条件]进行测定，记录峰面积并计算样品中各成分的含量。结果表明，各成分含量的RSD均小于3%，本方法可满足试验要求，耐用性良好。

2.11 样品含量测定

取各批药材样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下方法进行衍生化处理，再按“2.1”项下试验条件进行测定，记录峰面积并按外标法计算样品中6种成分的含量，结果见表3。

3 讨论

有研究认为，三萜酸类成分本身并无共轭体系，因此采用紫外-分光光度法很难准确地测定其含量[15-16]。此外，由于熊果酸与齐墩果酸、山楂酸与科罗索酸互为同分异构体，采用液相、气相等色谱法很难将这两对同分异构体分离。而有研究发现，采用柱前衍生荧光标记技术可增大同分异构体间的差异，从而实现其在液相色谱上的分离[15]。为此，本研究参考上述文献，采用HPLC/FLD-APCI/MS法对悬钩木中6种三萜酸类成分进行测定，结果表明，该方法灵敏度高、选择性强。

本研究考察了不同色谱柱（Agilent Hypersil C18、Agi- lent Hypersil BDS C8、Agilent Hypersil BDS C18、 Agilent Spherisorb C18）的分离效果，结果显示，以Agilent HypersilC18为色谱柱时的分离度最好。同时，对甲醇-水、乙腈-水等不同流动相体系进行了比较，结果发现，以甲醇为流动相时柱压较高、基线偏移较大，而以5%乙腈水溶液-乙腈洗脱效果最好、基线平稳，因此选择5%乙腈水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱。

含量测定结果显示，悬钩木各部位中三萜酸类成分含量存在明显差异，悬钩木茎中齐墩果酸和熊果酸含量较高，分别为2 732.5、2 598.3 µg/g，其次为悬钩木叶，而悬钩木根中含量最低;悬钩木茎中的山楂酸、桦木酸和科罗索酸含量相对较高，在101.5～262.7 µg/g之间。而路路通酸在悬钩木各部位中均未检出。这可能与所采集悬钩木药材的生长环境等因素有关[8]。

综上所述，本研究方法准确、可靠，专属性好，可用于同时测定藏药悬钩木中6种三萜酸类成分的含量。

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（收稿日期：2019-03-19 修回日期：2019-06-28）

（编辑：陈 宏）