外泌体联合丝素蛋白支架对软骨缺损的修复作用

景雷　欧爱春　李亚男　王英振

[摘要]目的探讨多聚蛋白多糖（Aggrecan）过表达载体修饰骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源外泌体联合丝素蛋白支架对新西兰大白兔软骨缺损的修复作用。方法培养兔源性BMSCs，流式细胞仪检测第2代BMSCs表面蛋白CD44、CD29、CD34和CD45表达。慢病毒Aggrecan过表达质粒转染BMSCs，超速离心法提取外泌体，Western Blot方法检测外泌体分子标志物CD81和CD63的表达。构建丝素蛋白支架联合外泌体复合物，利用扫描电镜技术检测丝蛋白支架的结构。利用苏木精`-伊红（HE）染色和番红`-快绿染色检测新西兰大白兔软骨缺损模型中软骨结构。结果第2代BMSCs表面蛋白CD44和CD29表达分别为60.2%和58.3%，CD34和CD45表达分别为3.4%和2.6%。慢病毒Aggrecan過表达载体转染效率为（95±2）%。扫描电镜观察显示，外泌体为直径40～100 nm双层膜的膜状结构。Western Blot检测显示，外泌体可以表达分子标志物CD81和CD63。HE染色和番红`-快绿染色结果显示，Aggrecan过表达载体修饰BMSCs分泌的外泌体联合丝素蛋白支架对软骨缺损的修复作用明显优于BMSC组和阴性对照组（F=19.298、12.548，P<0.05）。结论Aggrecan过表达载体修饰BMSCs分泌的外泌体联合丝素蛋白支架对软骨缺损的修复具有明显的促进作用，可为骨性关节炎治疗提供新的思路与方法。

[关键词]外泌体;间充质基质细胞;丝素蛋白支架;骨关节炎

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of exosome derived from Aggrecan overexpression vector`-modified bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） combined with silk fibroin scaffold in the repair of cartilage defect in New Zealand white rabbits. MethodsRabbit`-derived BMSCs were cultured. Flow cytometry was used to measure the expression of CD44， CD29， CD34， and CD45 on the surface of the second`-generation BMSCs. Lentivirus Aggrecan`-overexpression plasmid was transfected into BMSCs， the exosomes were extracted by ultracentrifugation， and Western blot was used to measure the expression of the biomar`-kers CD81 and CD63. The silk fibroin scaffold`-exosome complexes were constructed， and scanning electron microscopy was used to observe the structure of silk fibroin scaffolds. HE staining and safranine`-fast green staining were used to observe cartilage structure in New Zealand white rabbits with cartilage defect. ResultsThe expression rates of CD44 and CD29 on the surface of the se`-cond`-generation BMSCs were 60.2% and 58.3%， respectively， and the expression rates of CD34 and CD45 were 3.4% and 2.6%， respectively. The transfection efficiency of lentiviral Aggrecan`-overexpression vector was （95±2）%. Scanning electron microscopy showed that the exosome had a double`-membrane structure with a diameter of 40-100 nm. Western blot showed that exosomes expressed the molecular markers CD81 and CD63. HE staining and saffron`-fast green staining showed that exosomes secreted by Aggrecan overexpression vector`-modified BMSCs combined with silk fibroin scaffold had a better effect in repairing cartilage defect than the BMSC group and the negative control group （F=19.298 and 12.548，P<0.05）. Conclusionexosomes secreted by Aggrecan overexpression vector`-modified BMSCs combined with silk fibroin scaffold can significantly promote the repair of cartilage defect， which provides new ideas and methods for the treatment of osteoarthritis in clinical practice.

[KEY WORDS]exosome; mesenchymal stromal cells; silk fibroin scaffold; osteoarthritis

骨性关节炎（OA）是关节外科最常见的疾病，也是目前临床上的治疗难题，其病理机制主要为软骨细胞过度凋亡和软骨基质降解而导致的软骨缺损[1`-3]。多聚蛋白多糖（Aggrecan）是软骨基质合成最主要的成分[4`-5]。骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有多向分化潜能，在特定诱导条件下，可以分化成人体内的多种细胞[6`-8]，如成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞等[9`-11]。新近研究结果表明，BMSCs在特定诱导条件下可以转化成成骨细胞，进而促进骨与软骨损伤的修复;而且BMSCs来源于病人自体，移植后可以避免排斥反应，这为临床上骨缺损的修复提供了一个新的思路[12]。本研究利用BMSCs的多分化潜能，构建Aggrecan的过表达载体转染BMSCs，收集外泌体，联合丝素蛋白支架，探讨其对于软骨缺损的修复作用，以期寻找最优化的治疗方案，为OA的治疗提供新的思路。

1材料与方法

1.1实验材料

新西兰大白兔20只，雌性，年龄为（12.11±3.04）月，体质量（5.47±1.01）kg，购自山东省济南市实验动物中心;胎牛血清购自Gibco公司;DMEM、TRIZOL及2.5 g/L的胰酶Trypsin均购自美国Invitrogen公司;氯仿、乙醇（体积分数0.75）及逆转录试剂盒均购自美国ABI Applied Biosystems公司;Real`-time PCR仪购自美国bio`-rad公司。

1.2實验方法

1.2.1BMSCs分离和培养将兔麻醉后，消毒，铺巾，利多卡因20 mL局部麻醉，利用骨穿穿刺针采集新鲜骨髓，按1∶3体积比加入含体积分数0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素的DMEM细胞培养液，充分混匀后，移入25 cm2的Hank培养瓶中，差速培养法培养，3 d后去掉培养瓶中的油脂等杂质，之后每3 d换1次细胞培养液。BMSCs细胞融合率达70%～80%后进行传代培养。

1.2.2BMSCs鉴定采用流式细胞仪检测BMSCs表面蛋白CD29、CD44、CD34和CD45的表达，采用倒置光学显微镜观察BMSCs的细胞形态。

1.2.3慢病毒Aggrecan过表达载体构建兔源性Aggrecan基因序列从Pubmed genebank中获得，序列号为NW_003159560;大小为40 893 bp（DNA linear CON 23`-JUN`-2016）;按照RNA过表达序列的构建原则，构建Aggrecan过表达序列，以环状质粒pHBLV`-U6`-ZsGreen`-PGK`-Puro作为质粒的克隆载体。利用慢病毒转染Aggrecan过表达载体。Aggrecan过表达质粒的构建和慢病毒的转染均由上海吉凯公司完成。

1.2.4慢病毒细胞转染取第2代BMSCs，将细胞接种到6孔板，待融合率为50%时进行慢病毒转染，根据转染说明书操作，转染复数（MOI）=50，慢病毒滴度为3×107 mg/L。慢病毒转染效率=荧光下视野细胞/白光下视野细胞×100%。

1.2.5外泌体的提取和鉴定采用超速离心法收集BMSCs的外泌体，将Aggrecan过表达载体转染72 h 的BMSCs和无病毒转染的BMSCs，加入无血清的DMEM培养液，使BMSC的外泌体分泌到培养液中，然后将收集的培养液加入到低温超速离心机中，分别设置转速和时间为：300 r/min，15 min;2 000 r/min，15 min;10 000 r/min，30 min;100 000 r/min，70 min。收集纯净外泌体，利用扫描电镜进行形态鉴定。

1.2.6丝素蛋白支架的制备和检测利用盐沥滤法将2 mL浓度为100 g/L的丝素蛋白溶液灌入24孔板中，加入450～600 μm的NaCl颗粒，室温风干3 d，盐析法成型后将丝素蛋白支架晾干，修剪成10 mm×10 mm×10 mm大小圆柱状丝素多孔支架，消毒后备用。利用扫描电镜检测支架结构。

1.2.7实验分组及处理取20只成年健康新西兰大白兔，随机分为空白组、BMSCs组、阴性对照组、实验组，每组5只。各组动物用150 g/L水合氯醛静脉麻醉（3 mL/kg）后，常规消毒铺无菌单，取膝关节正中侧切口，逐层切开皮肤、皮下软组织、浅深筋膜，显露膝关节股骨侧，使用口腔钻在其软骨层进行钻孔，形成长5 mm、宽2 mm、深3 mm的锥形软骨缺损，制成软骨缺损模型，生理盐水冲洗，进行相应干预后逐层缝合。空白组：造模后植入丝素蛋白支架;BMSCs组：造模后植入丝素蛋白支架+BMSCs外泌体复合物;阴性对照组：造模后植入丝素蛋白支架+转染空白载体BMSCs外泌体复合物;实验组：造模后植入丝素蛋白支架+转染Aggrecan过表达载体BMSCs外泌体复合物。

1.2.8苏木精`-伊红（HE）染色和番红`-快绿染色方法检测软骨缺损兔模型的软骨结构14 d后，将实验动物处死，取4组新西兰大白兔软骨缺损组织行HE染色和番红`-快绿染液染色，40 g/L多聚甲醛固定30 min;脱钙处理4周;过二甲苯Ⅰ处理15 min，二甲苯Ⅱ10 min，二甲苯Ⅲ 10 min;体积分数1.00、0.95、0.90、0.85乙醇梯度处理各5 min;二甲苯Ⅰ15 min，二甲苯Ⅱ 10 min，二甲苯Ⅲ 10 min，体积分数1.00、0.95、0.90、0.85乙醇各处理5 min，自来水冲洗5 min， HE染液和番红`-快绿染液染色5 min，封片，倒置光学显微镜观察。应用改良O’Driscoll 评分系统评估HE染色结果，改良Mankin评分评估番红`-快绿染色结果。

1.3統计学方法

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，结果用±s形式表示，多组数据比较采用单因素方差分析方法，组间两两比较采用q检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1BMSCs的培养和鉴定

接种48 h后，原代BMSCs开始贴壁，细胞呈梭形或者多角形;培养至第2代后，细胞呈旋涡状或者辐射状生长，增殖迅速。流式细胞仪检测显示，第2代BMSCs表面蛋白CD44和CD29的表达率分别为60.2%和58.3%，CD34和CD45的表达率分别为3.4%和2.6%。

2.2慢病毒转染BMSCs效率

慢病毒转染72 h后观察显示，慢病毒转染效率较高，为（95.07±2.11）%。

2.3扫描电镜下外泌体联合丝素蛋白支架复合体的结构

扫描电镜下不同视窗观察显示，支架表面粗糙、凹凸不平，有利于细胞黏附和迁移。

2.4外泌体的形态学和标志物鉴定

扫描电镜观察显示，外泌体为直径40～100 nm的双层膜膜状结构。Western Blot检测显示，外泌体可以表达分子标志物CD81和CD63。

2.5软骨缺损兔模型软骨缺损部位HE染色和番红`-快绿染色观察

HE染色显示，空白组软骨缺损范围大，炎症细胞浸润多;BMSCs组软骨缺损范围较空白组明显减小;阴性对照组炎性细胞减少，支架略有消失;实验组炎性细胞明显减少，支架消失，血管生成。实验组改良O’Driscoll评分低于空白组、BMSCs组、阴性对照组，BMSCs组评分高于空白组，差异均有显著性（F=19.298，P<0.01）。番红`-快绿染色结果显示，空白组软骨缺损范围大，并伴有软骨下骨硬化;BMSCs组软骨缺损范围较空白组明显减小;实验组软骨缺损部位有明显修复，且为纤维组织修复。实验组改良Makin评分高于空白组、BMSCs组、阴性对照组，BMSCs组评分高于空白组，差异均有显著性（F=12.548，P<0.05）。见表1。

3讨论

本研究根据基因工程和组织工程的原理，以体外培养新西兰大白兔来源的BMSCs为研究细胞，利用siRNA过表达技术构建Aggrecan的过表达载体，转染BMSCs，提取转染后干细胞来源的外泌体，并且通过构建丝素蛋白支架+外泌体复合体，对新西兰大白兔软骨缺损部位进行填充和修补，探讨Aggrecan过表达载体修饰BMSCs分泌的外泌体对软骨缺损的修复作用，以期为临床上具有外侧间室软骨缺损的OA治疗提供新的方法。既往研究表明，利用BMSCs复合异种骨基质明胶可以有效修复大鼠桡骨缺损，提示组织支架可以促进BMSCs向骨细胞转化，进而修复软骨缺损部位[13`-15]。但是这种方法需要符合特定条件的组织工程支架体系，也就是需要特殊的“土壤”，BMSCs这个“种子细胞”才能更好地在其内生长并且分化，但其临床应用的安全性有待进一步研究[16`-17]。有研究显示，利用慢病毒构建基因载体转染BMSCs并不影响BMSCs的表型[18`-21]。另有研究显示利用基因工程原理，构建基因过表达的BMSCs也是提高“种子”有效分化的手段[22`-24]。本研究基于该理论，构建Aggrecan基因过表达质粒慢病毒载体转染BMSCs，制作新型“基因种子”，结果表明，Aggrecan基因过表达质粒慢病毒载体转染BMSCs具有较高的转染效率，高达90%以上，可见慢病毒介导Aggrecan基因过表达质粒转染BMSC是一种高效的转染方法。

外泌体为一种新兴的手段，可以作为无细胞物质提取治疗OA的手段之一[25`-28]。有研究结果显示，在一定条件下，BMSCs可以促进软骨细胞分化[29]，然而具体的作用机制未知。本研究利用超高速离心的方法，提取Aggrecan基因过表达质粒慢病毒载体转染BMSCs来源的外泌体，并且利用组织工程原理，构建丝素蛋白支架，联合外泌体，构建外泌体+丝素蛋白支架体系。进而将基因修饰后干细胞来源外泌体与组织工程支架相结合，通过扫描电镜观察外泌体联合丝素蛋白支架复合体的结构，可观察到支架表面粗糙、凹凸不平，有利于细胞黏附和迁移。另外，我们还利用新西兰大白兔构建膝关节软骨缺损模型，应用外泌体+丝素蛋白支架复合体对软骨缺损部位进行填充和修复，HE染色和番红`-快绿染色对软骨缺损部位进行观察，结果表明，实验组改良O’Driscoll评分低于空白组、BMSCs组、阴性对照组，实验组改良Makin评分高于空白组、BMSCs组、阴性对照组，差异具有统计学差异，说明外泌体+丝素蛋白支架复合体可以对软骨缺损部位进行更有效的修复。

综上所述，Aggrecan过表达载体修饰BMSCs分泌的外泌体联合丝素蛋白支架复合体可以对软骨缺损部位进行有效的修复，可以为临床上OA治疗提供新的思路与方法。

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