沼渣与餐厨废弃物、牛粪联合堆肥的腐殖化进程研究

2019-09-09黄振兴谢利娟阮文权

农业机械学报 2019年8期

白玲李倩邓芸黄振兴谢利娟阮文权

(1.江南大学环境与土木工程学院，无锡 214122； 2.江苏省厌氧生物技术重点实验室，无锡 214122)

0 引言

随着沼气工程的快速发展，厌氧发酵技术已广泛应用于处理各种有机废弃物，但是产生大量的沼渣亟需处理。污泥沼渣和秸秆沼渣分别是城市污水处理厂污泥和稻秸经过厌氧发酵后的渣滓，可能含有病原微生物和氨氧化物质等污染物；醋糟是玉米、高粱等与大量麸皮和稻壳等添加物进行醋酸发酵后的剩余物，含有大量木质纤维等不可分解物质，影响其利用效率[1]。这些沼渣中含有丰富的营养物质和有益微生物，可用作肥料或土壤改良剂，但是直接施用可能会给土壤和水带来潜在风险。堆肥被认为是循环再利用有机废弃物的有效方法之一，且可产生安全稳定的堆肥产品[2]。但有学者指出沼渣中可降解物质含量较低，不适宜单独堆肥[3-4]，联合餐厨废弃物和牛粪进行混合堆肥可弥补沼渣单独堆肥的缺陷。

堆肥过程是有机物质在多种微生物及其分泌的酶共同作用下，发生矿化和腐殖化作用，转化为稳定的腐殖质类物质，堆肥的质量也与其稳定性存在显著相关性[5]。矿化过程主要是在水解酶作用下进行，而腐殖化过程则是在氧化还原酶作用下进行[6]，因此，堆肥过程中酶活性的变化可反映堆肥的腐殖化程度。腐殖化过程也是小分子有机物逐渐形成大分子腐殖质类物质过程。研究表明，在堆肥过程中微生物可以利用富里酸作为能源物质形成更加稳定的胡敏酸[7-8]，增加腐殖质中胡敏酸的含量[9]，从而加速堆肥的腐熟。目前对于堆肥过程腐殖化研究较多[8, 10-12]，沼渣堆肥的研究也主要集中在禽畜粪便的沼渣[3, 13-15]，而对于其他沼渣堆肥腐殖化过程腐殖酸的分子量及腐殖化特征变化研究较少。本文分别以污泥沼渣、秸秆沼渣和醋糟为主原料，与餐厨废弃物和牛粪联合进行堆肥，探究其堆肥过程中脱氢酶、纤维素酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶活性的变化及腐殖化特征，为沼渣的高效资源化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

污泥沼渣取自无锡新城污水处理厂厌氧发酵、压滤后污泥；秸秆厌氧沼渣取自江苏省厌氧生物技术重点实验室中长期稳定运行的厌氧反应器中；醋糟取自江苏省某食醋生产企业；餐厨废弃物取自江南大学食堂；牛粪和秸秆取自江苏省某农场，其基础理化性质见表1。

表1 堆肥原材料基础理化性质Tab.1 Physicochemical characteristics of different raw materials for composting

1.2 实验设计

本实验采用模拟堆肥，在江苏省厌氧生物技术重点实验室进行。设置污泥沼渣(Sludge residue, SLR)、秸秆沼渣(Straw residue, STR)、醋糟(Vinegar residue, VR)为主要原料的3组实验，每组实验重复3次。混合物料初始碳氮比约为25，含水率为60%～70%，其中SLR组沼渣、餐厨废弃物、牛粪、秸秆干质量比为13∶3∶3∶6，STR和VR组相应值为13∶3.25∶3.25∶3.25和13∶3∶3∶1。将混合物料混合均匀后装入体积为5 L的泡沫箱中，整个堆肥发酵周期为30 d，采用翻堆方式进行通风。在堆肥前10 d，每2 d翻堆一次，以保证足够的通气量，在11～30 d，每5 d翻堆一次。每6 d取一次样品，采用多点法取样，混合均匀后分为两部分，一部分保存在4℃冰箱中，用于酶活性、溶解性有机物(DOM)含量的测定；另一部分在阴凉通风处风干后，磨碎，过1 mm筛，用于腐殖质各组分及分子量的测定。

1.3 测定项目与方法

1.3.1酶活性的测定

脱氢酶活性采用氯化三苯基四氮唑(TTC)比色法[16]；多酚氧化酶活性的测定采用邻苯三酚比色法[17]；脲酶活性的测定采用靛酚蓝比色法[17]；纤维素酶活性的测定采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)比色法[17]。

1.3.2腐殖质各组分的提取与分析

称取2 g样品于50 mL离心管中，加入40 mL 0.1 mol/L NaOH与0.1 mol/L Na4P2O7混合液，混合均匀后，在30℃ 150 r/min条件下振荡24 h，静置后5 000 r/min离心10 min，用0.45 μm滤膜过滤，得到滤液，此为腐殖质(HS)；取一定量滤液用6 mol/L HCl调至pH值至1，在4℃保存12 h，此时沉淀为胡敏酸(HA)，上清液为富里酸(FA)，慢速定性滤纸过滤后，用0.05 mol/L NaHCO3溶液溶解沉淀，富里酸(FA)利用差减法计算，各组分中TOC(总有机碳)含量利用TOC测定仪测定。

1.3.3腐殖质分子量测定

采用高效凝胶色谱法(HPGFC)，色谱条件：色谱柱Ultrahydrogel TM Linear 300 mm×7.8 mm id×2；流动相为0.1 mol/L硝酸钠，流速为0.9 mL/min，柱温为30℃。分子量校正曲线所用葡萄糖标准品(均购置于Sigma公司)为：Dextran T-2000、Dextran T-150、Dextran T-40、Dextran T-10、Dextran T-5、葡萄糖180。

1.3.4荧光光谱测定

荧光光谱测定仪器为F-7000型荧光光度计(日本日立公司)。该仪器激发光源为150 W氙灯，PMT(光电倍增管)电压400 V；响应时间为自动，扫描光谱进行仪器自动校正。三维荧光光谱扫描时激发波长为220～450 nm，发射波长为220～500 nm，扫描速度设定为2 400 nm/min，每个样品TOC浓度调至10 mol/L。

1.3.5数据计算与统计分析

腐殖化系数(Humification ratio,HR)计算公式为

(1)

式中S——腐殖质碳质量比,g/kg

T——总有机碳质量比,g/kg

腐殖化指数(Humification index,HI)计算公式为

(2)

式中H——胡敏酸碳质量比,g/kg

聚合程度(Degree of polymerization,DP)计算公式为

(3)

式中F——富里酸碳质量比,g/kg

胡敏酸占有率(Percentage of HA，PHA)计算公式为

(4)

采用Excel 2016和Origin 2016进行数据分析统计。

2 结果与讨论

2.1 温度和含水率

图1 堆肥过程中温度和含水率变化曲线Fig.1 Changes of temperature and moisture content during composting

在堆肥过程中，温度的变化直接影响微生物的活性并决定有机物质的稳定性[18]。由图1a可知，堆肥进行第1天温度逐渐升高，其中STR在第2 天就达到50℃，最高温度出现在第4天(56℃)且高温期(≥50℃)持续7 d；SLR在第7天达到50℃并维持3 d；VR分别在第2天和第16天出现高温(50℃)但也仅维持1 d，随后呈波动性下降，这可能是由于醋糟颗粒较大，使得堆体的孔隙较大，导致热量容易散失，到后期充足的氧气和有机物质使微生物活性增加，提高了堆肥温度。STR有较长时间的高温期，可能是由于复杂有机成分降解为简单的小分子化合物供微生物利用造成堆肥过程中持续的高温[19-20]，加速堆肥腐熟。堆肥前期出现的短期低温现象是由翻堆所致，但不到1 d温度会回升，这与MUKESH等[16]和AWASTHI等[21]研究结果一致。

含水率是堆肥过程中重要的指标之一，水分为养分的运输和有机质的降解提供介质。堆肥过程中含水率的变化如图1b所示。SLR、STR和VR的初始含水率分别为63.94%、65.32%和67.88%，随着堆肥的进行，含水率逐渐降低，这主要是由微生物活动产生热量导致水分蒸发所致。SLR在堆肥前6 d含水率增加，可能是由于部分有机物质发生水解。到堆肥结束时，SLR的含水率较高，为47.45%，其次是STR，为37.01%，VR的含水率最低。在堆肥后期，堆体温度已降低，水分的减少主要依靠翻堆或通气。醋糟的颗粒较大，导致堆体的通气性较好，保水性能较差，因此，在堆肥后期，与SLR相比，VR的含水率下降较快。

2.2 堆肥过程酶活性的变化

2.2.1脱氢酶和纤维素酶

脱氢酶直接参与微生物的呼吸作用，其活性可反映微生物对有机物降解能力和有机物腐殖化程度[22-23]。3组实验中脱氢酶活性变化均呈现先升高后逐渐降低的趋势(图2a、2b、2c)，且最高值均出现在堆肥的第6天(此时处在高温阶段)，分别为63.79、50.18、63.81 μg/(g·h)。在高温期，微生物分泌大量脱氢酶以分解有机物质为自身的生长和繁殖提供营养。堆肥结束时，SLR脱氢酶依然保持较高活性，为19.25 μg/(g·h)，说明还存在部分不稳定有机物；而STR和VR的脱氢酶活性较低，分别为4.45 μg/(g·h)和1.18 μg/(g·h)，表明大部分有机物质已被微生物降解并转化为稳定的物质，呼吸过程减慢[24]。由此说明，STR和VR均已腐熟，而SLR还不稳定。

纤维素酶与纤维素代谢有关，可将纤维素水解为葡萄糖等小分子化合物。如图2d、2e、2f所示，在堆肥前12 d，3组实验的纤维素酶活性随着堆肥时间逐渐降低，主要由于温度开始上升，微生物的代谢活力和水平处在较低状态，此时微生物只利用简单易降解的小部分纤维素类有机物，而体系中可被利用的有机物质仅供微生物大量繁殖，无法刺激微生物大量产生酶类等次生代谢产物。12 d后，SLR和 STR的纤维素酶活性逐渐增加，表明易降解有机物质被消耗殆尽，微生物开始利用大分子纤维素等有机物质分解代谢，刺激微生物次生代谢，产生纤维素酶，使纤维素酶活性增加，与SLR相比，STR的纤维素酶活性较高，为5.06 mg/(g·d)；VR在12 d以后，纤维素酶活性先增加后降低，在第24天后又增加，主要由于堆肥体系中水分、营养物质等减少，使微生物活性降低，次生代谢产物部分有累积。由此可见，在秸秆沼渣堆肥中更有利于纤维素的降解，从而使堆肥产品更稳定。

图2 堆肥过程中脱氢酶和纤维素酶活性变化Fig.2 Changes of dehydrogenase and cellulase activities during composting

2.2.2脲酶和多酚氧化酶

脲酶是一种与氮素循环有关的酶，可促进脲素分子中的酰胺键水解，其活性的高低反映有机物降解过程中含氮物质的矿化进程，是表征堆肥腐殖化的重要指标[25]。图3a、3b、3c为不同沼渣堆肥过程中脲酶活性变化情况。在堆肥前期SLR和STR呈现逐渐降低的趋势，其原因是开始时易降解有机物质充足，微生物分泌的脲酶将有机物中的脲素态氮水解为氨，随着堆肥的进行，脲素态氮含量减少和微生物活性减弱导致脲酶活性减弱；而VR则为先降低后增加，其中在第6天最低(0.39 mg/(g·d))，第18天达到最大值(270.47 mg/(g·d))，这可能由于在第6天时，pH值较低(4.44)，抑制了脲酶活性，随后pH值增加，脲酶活性增加。在堆肥18 d后，脲酶活性降低，直至堆肥结束。在堆肥结束时，STR的脲酶活性最低，为1.93 mg/(g·d)，其次为VR(5.45 mg/(g·d))，SLR最高，为6.22 mg/(g·d)，说明STR组有机物质处于稳定状态且腐殖化程度较高。

多酚氧化酶可以将一些芳香族化合物氧化为醌，同时催化醌与堆肥体系中的蛋白质、氨基酸、糖类及矿物质等反应生成交联状的稳定大分子物质，利于堆肥的腐殖化[6]。由图3d可以看出，SLR的多酚氧化酶活性在整个堆肥过程较低，这可能是因为污泥沼渣中多蛋白质等易降解有机物，可刺激微生物分泌酶的底物含量较少，导致微生物分泌的多酚氧化酶较少；STR和VR在初始时多酚氧化酶活性较高，在第6天最低，随后变化不大，但VR在24 d时增加随后又降低，可能是由于微生物活性降低导致次生代谢产物的累积；与SLR和VR相比，STR在整个堆肥过程中多酚氧化酶活性较高，在堆肥结束时，为2.04 mg/(g· h)，说明秸秆沼渣堆肥在后期以蛋白质、氨基酸等物质为营养物质的异养微生物代谢活性较低，促进腐殖质的形成，从而加速堆肥腐殖化进程。

图3 堆肥过程中脲酶和多酚氧化酶活性变化Fig.3 Changes of urease and polyphenol oxidase activities during composting

2.3 腐殖质各组分含量及腐殖化程度的变化

堆肥过程中，纤维素被微生物降解后转化为小分子化合物，如多糖等，此类小分子物质具有良好的生物降解性能并与氨基化合物聚合，可形成腐殖质的前体物质[7]。如表2所示，堆肥后，HS-C含量增加，且STR中HS-C含量最高，SLR、STR和VR分别增加了5.71%、10.56%、1.53%。腐殖质主要是由胡敏酸和富里酸组成的一系列与微生物和酶有关的高分子有机聚合物。堆肥的腐殖化过程使HA-C含量增加，而FA-C含量降低，这与许多前人的研究结果一致[7,9,26]。SLR、STR和VR处理HA-C质量比分别增加了17.55、17.30、3.07 g/kg，并且STR胡敏酸含量最高，这可能与原料中纤维素含量有关，同时影响微生物和酶的活性。堆肥后，SLR的FA-C含量变化最大，减少了31.33%，STR次之，VR变化最小。有研究表明富里酸减少主要是由于富里酸的分子较小，微生物可以利用转化为分子大且结构复杂稳定的胡敏酸[27]。

堆肥过程的腐殖化不仅要考虑腐殖质、胡敏酸和富里酸含量的变化，更要认清这些参数与TOC以及它们之间的相互关系。HR、HI、DP和PHA在堆肥前后变化如表2所示。在堆肥过程中有机碳逐渐腐殖化，最终使得堆肥系统稳定。堆肥后HR增加，表明碱性条件下可溶性碳含量增加，而HI的增加则表明腐殖质的结构逐渐复杂，腐殖质分子在逐渐增大。在堆肥过程中，前体物质不仅参与了HS结构的形成，还增加HS的芳香化程度。DP表示在HS中HA与FA的比例，堆肥后DP的增加表明堆肥过程中小分子FA转化为大分子HA，增加了HS的复杂程度。PHA表示HA在HS中占有率，堆肥后PHA增加，表明HA在HS中的含量增加，由此表明HA是构成HS的主要组分。堆肥后，相比SLR和VR，STR的HR、HI、DP和PHA最大，分别为28.89%、19.24%、1.99和66.60%，其次为SLR，VR最小，这可能原因是在STR中，纤维素的降解可提供更多的芳香化合物，使腐殖质的结构更加复杂和稳定，加快堆肥腐熟。

表2 不同沼渣堆肥前后腐殖质各组分及HR、HI、DP、PHA变化Tab.2 Changes of humus composition, HR, HI, DP and PHA before and after composting

注：HS-C表示腐殖质碳，HA-C表示胡敏酸碳，FA-C表示富里酸碳。

2.4 堆肥前后腐殖酸分子量的变化

堆肥使有机物质逐渐稳定，转化为腐殖质类物质，即将小分子转化为大分子。腐殖酸主要是由胡敏酸和富里酸组成，其中胡敏酸的分子量较大。如图4所示，堆肥后腐殖酸的分子量增加，其中SLR在堆肥前后腐殖酸分子量的变化不明显，胡敏酸和富里酸的分子量分别从堆肥前2 024 Da和585 Da变为堆肥后2 061 Da和566 Da。对于STR和VR，腐殖酸的分子量分别从堆肥前3 284 Da和2 090 Da变为堆肥后3 929 Da和3 990 Da，主要原因是堆肥后胡敏酸的分子量增加，使腐殖酸分子量增加。堆肥前后SLR中腐殖酸分子量没有变，但其胡敏酸的含量增加(表2)，说明在SLR中是小分子之间相互作用形成大分子胡敏酸，而大分子胡敏酸与小分子之间几乎不发生相互作用。而对于STR和VR，不仅小分子之间发生相互作用，而且小分子与大分子胡敏酸之间也会发生相互作用，使胡敏酸的分子量增加，最终使腐殖质的分子量增加。

2.5 溶解性有机物的三维荧光特性变化

腐殖质一般是含有大量有机物、结构复杂且不均匀的混合物，也包括不同基团和分子量的多聚体以及各种荧光基团[28]。图5(图中Ex、Em表示激发波长、发射波长)为不同沼渣堆肥前后DOM的三维荧光光谱变化。不同来源的DOM可能具有不同的荧光基团，主要为类蛋白荧光峰、简单芳香蛋白荧光峰、可见光区类腐殖酸峰和紫外光区类腐殖酸峰[29-31]。如图5f所示，堆肥后出现了4个不同的荧光峰，在图中标记为A、B、C和D，其中A表示可见光区类腐殖酸物质，B表示紫外光区类蛋白，C和D表示紫外光区类腐殖酸和简单芳香蛋白。在堆肥前，SLR、STR和VR主要含B和D两类荧光物质，且VR中含量更高。堆肥后，SLR处理出现了A类物质，B和D变化不明显，但在STR和VR中出现了A和C两类物质，并且B和D两类物质含量减少，说明A和C可能是由B、D类物质转化而成。与STR比，VR更明显，可能是由于VR中B、D类物质含量多。由此可见，秸秆沼渣和醋糟的堆肥腐殖化效果较好。