中国马铃薯病虫害检测技术标准解析

2019-09-09范国权白艳菊高艳玲邱彩玲胡林双

中国马铃薯 2019年4期

范国权，白艳菊，高艳玲，张威，张抒，申宇，邱彩玲，胡林双，孙妍，喻江

（1.黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江哈尔滨 150086；

2.农业农村部工程建设服务中心，北京 100000；3.哈尔滨商业大学，黑龙江哈尔滨 150028）

马铃薯是一种营养体无性繁殖植物，植株和块茎都易感病，侵染马铃薯的病虫害有几十种，主要包括真菌、细菌、病毒、类病毒、甲虫、线虫等。这些病虫害可以随种薯传播，其中，细菌、病毒和类病毒病害还可以通过种苗传播，造成病害大面积扩散，严重影响马铃薯的产量和质量。病虫害一般可造成马铃薯减产10%～30%，严重情况下减产可达70%以上，是影响马铃薯产业发展的瓶颈之一。因此，在马铃薯生产中病虫害检测工作极为重要，及时发现并确认病虫害，有利于其有效防控，可以防止大面积扩散，降低产量和质量损失。

现有28个病虫害检测标准，其中涉及马铃薯细菌检测标准4个，病毒检测标准10个，类病毒检测标准4个，真菌检测标准7个，甲虫检测标准1个和线虫检测标准2个。从检测病虫害种类看，可检测病虫害包括细菌性病害青枯病[Ralstonia solanacearum（Smith）] 和环腐病（Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus）；病毒病有马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）、马铃薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）、马铃薯X 病毒（Potato virus X，PVX）、马铃薯A 病毒（Potato virus A，PVA）、马铃薯M 病毒（Potato virus M，PVM）、马铃薯S 病毒（Potato virus S，PVS）、马铃薯V 病毒（Potato virus V，PVV）、马铃薯帚顶病毒（Potato mop-top virus，PMTV）和马铃薯黄化矮缩病毒（Potato yellow dwarf virus，PYDV）；类病毒有马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid，PSTVd）；真菌病害包括马铃薯银屑病（Helminthosporium solani Durieu et Mont.）、马铃薯黑粉病[Thecaphora solani（Thirumalachar & O.Brien）Mordue]、马铃薯坏疽病（Phoma exigua var.foveata）、马铃薯绯腐病（Phytophthora erythroseptica Pethybridge）、马铃薯炭疽病[Colletotrichum coccodes（Wallr.）Hughes]、马铃薯皮斑病[Polyscytalum pustulans（M. N. Owen et Wakef.）M. B. Ellis]和马铃薯癌肿病[Synchytrium endobiticum（Schilberszky）Percival]；马铃薯甲虫（Colorado potato beetle）[Leptinotarsa decemlineata（Say）]；线虫包括马铃薯白线虫（White potato cyst nematode）[Globodera pallida（Stone）Behrens]和马铃薯金线虫（Golden potato cyst nematode）[Globodera rostochiensis（Wollenweber）Behrens]，总计22种病虫害。

1 马铃薯病害检测技术及特点

目前，马铃薯病害检测最常用的技术有生物学检测法（Biology detection）、电镜检测技术（Technology of electron microscopy）、血清学方法（Serological detection assay）和分子生物学检测法。

1.1 生物学检测法

生物学检测法是最直观的一种检测技术，属于最基本的检查方法，根据植物发病症状进行病害诊断，适用于所有类型的病害。传统生物学检测技术检测马铃薯病毒病直观、容易操作、价钱便宜，除检测病毒外，还可以在形态学上提供病毒毒理指标[1]（表1）。但是，生物学检测技术鉴定周期长，需要特定的指示植物，同时需要严格控制环境条件，现已不能适应生产上快速检测的需要。

1.2 电子显微镜检测

电子显微镜特有的高分辨率特性，在马铃薯病害检测、超微结构及形态观察中发挥了重要作用。目前常用的有透射电子显微镜、扫描电子显微镜、环境扫描电子显微镜、扫描隧道显微镜及原子力显微镜等新型电镜。电子显微镜可以清晰地看到微小的病毒粒体，病原微生物侵染植物的过程，还可以直接观察到细胞结构和细胞器被破坏的过程。

1.3 血清学检测方法

血清学方法是病毒诊断和鉴定的基础方法，用于植物病毒检测的血清学方法主要包括酶联免疫吸附法、斑点免疫结合测定法、免疫扩散、免疫电泳、荧光免疫等。目前，应用最为广泛的是酶联免疫吸附法、斑点免疫结合测定法、免疫胶体金技术。在马铃薯病害检测中，最常用的是双抗体夹心法（Double antibody sandwich enzyme-link immunoassay，DAS-ELISA）。

1.4 分子生物学检测方法

马铃薯病虫害检测常用的分子生物学方法有聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）、反转录酶-聚合酶链锁反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）方法、实时定量PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）方法和实时定量RT-PCR（Quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）方法、核酸杂交检测技术（Nucleic acid spot hybridization， NASH）和免疫荧光检测技术（Immunofluorescence，IF）等。分子生物学方法对于常规方法研究较困难的植物病毒、类病毒，以及专性寄生病原菌的检测，显示了较强的优越性，技术灵敏度高，操作简便。其中，核酸杂交检测技术是目前马铃薯类病毒检测主要采用的技术，而免疫荧光检测技术在马铃薯细菌性病害检测中广泛应用。

表1 马铃薯病毒的鉴别寄主及症状Table 1 Host plants and symptoms of potato viruses

2 28个病害检测技术标准

2.1 马铃薯类病毒检测标准

涉及马铃薯类病毒检测技术标准共有5 项（表2）。《马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法》（GB/T 31790-2015）[2]和《马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法》（SN/T 3437-2012）[3]均由全国植物检疫标准化技术委员会提出。马铃薯类病毒作为国家检疫性病害，2 个标准中规定的检测方法包括生物学方法、往复聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Return-polyacrylamide gel electrophoresis，R-PAGE）、

RT-PCR方法和qRT-PCR方法。标准中规定生物学症状明显的样品，通过标准中一种方法检测为阳性，即可判断为样品携带PSTVd，如果未发现生物学症状，则需要通过不同原理的2 种方法进行检测，均为阳性的样品，判定样品携带PSTVd。从检疫角度出发，标准中规定的结果判定方法符合国际检疫性病害判定方法，结果严谨准确。

表2 马铃薯类病毒检测标准Table 2 Detection standard of potato spindle tuber viroid

《马铃薯纺锤块茎类病毒检测》（NY/T 1962-2010）[4]和《脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程》（NY/T 401-2000）[5]中规定了采用R-PAGE 和RT-PCR方法进行检测的具体流程，结果规定其中一种方法检测结果为阳性则样品中含有PSTVd。《马铃薯纺锤块茎类病毒检测核酸斑点杂交法》（NY/T 2744-2015）[6]，采用核酸探针的方法进行检测，结果出现蓝紫色斑点的样品为阳性样品。

由于类病毒没有蛋白外壳，因此在RT-PCR检测过程中，实验环境要多通风、设备紫外杀菌处理，防止检测中受到气溶胶的污染，造成假阳性。NASH 和R-PAGE 不受气溶胶影响，但R-PAGE 检测灵敏度较低，NASH 检测灵敏度与RT-PCR 相似，NASH方法操作简单，结果准确，对核酸要求不高，并在田间可以直接取汁液至检测的硝酸纤维素膜上，不需要将样品带回实验室，一次性检测样品多，适合大面积推广应用。因此，在实际的类病毒检测过程中，根据实验室的实际条件，选择适合的检测方法。条件符合的实验室最好选用NASH或RT-PCR方法检测。如果实验室条件有限，大田样品检测时可以使用R-PAGE 方法，但由于易受R-PAGE检测灵敏度的限制，可能出现漏检的情况。

2.2 马铃薯细菌病害检测标准

目前，马铃薯细菌性病害检测标准中，涉及环腐病标准有1个国家标准和1个检疫标准，青枯病有1个检疫标准。此外，在产地检疫标准中同时规定了青枯病和环腐病的检测方法（表3）。

《马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法》（GB/T 28978-2012）[7]和《马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法》（SN/T 1135.5-2007）[8]均由检疫部门提出申请完成，其中2007 版行业标准中规定检测方法为血清学和PCR 方法，结果需要2 种方法检测结果均呈阳性，才能判定样品含有环腐病。但是，目前用于血清学检测试剂不易购买，因此该标准只能采用PCR一种方法进行检测。

表3 马铃薯细菌病害检测标准Table 3 Detection standard of potato bacterium disease

《马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法》（GB/T 28978-2012）中规定了生物学检测、Biolog 鉴定、DAS-ELISA检测、PCR检测和致病性测定的方法，结果判定依据Biolog检测、DAS-ELISA检测或分子生物学检测（PCR方法或qPCR方法）结果，其中基于2种不同原理的方法检测结果呈阳性、且致病性测定为阳性时，判定为马铃薯环腐病菌。当DAS-ELISA 检测或分子生物学检测（PCR 方法或qPCR方法）初筛检测结果为阴性，或其中只有一种检测方法的结果为阳性时，判定为非马铃薯环腐病菌。该标准中的方法不仅需要实验室检测鉴定，还需要致病性鉴定，结果判定科学合理，严谨准确，符合检疫性病害国家判定方法，但该标准规定的方法实验周期较长，多数实验室不能满足要求。《马铃薯种薯产地检疫规程》（GB 7331-2003）[9]中规定可以使用革兰氏染色的方法鉴定马铃薯环腐病菌。若结果通过染色、显微镜观察，成蓝紫色的单个或2～4个聚集的短杆状菌体为革兰氏阳性菌，为环腐病菌，染成粉红色的即可排除环腐病菌，判定为革兰氏阴性反应，该方法容易操作、实验条件容易达到要求，但检测灵敏度较低，同时，该标准也规定了硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定法（Nitro cellulose-membrane-enzyme linked emmusorbent assay，NCM-ELISA）的检测方法。

《马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法》（SN/T 1135.9-2010）[10]规定了生理生化反应测定的结果可通过生物型区分、选择性培养基、血清学、PCR和qPCR方法进行判定，结果判定为血清学或PCR检测为阳性，即判定样品含有青枯病菌。

环腐病在中国部分区域时有发生，现行的3个标准中涉及的检测方法，建议选择灵敏度较高的PCR方法进行检测，如果实验条件不能满足可以选择革兰氏进行初筛，检出阳性后再运用不同原理方法进行检测，保证结果准确。在青枯病检测上，血清检测试剂盒市场上不容易购买，同时考虑到灵敏度等因素，建议采用PCR 方法进行检测和判定结果。目前，对产业影响较大的马铃薯黑胫病还没有标准支持检测工作，急需制定完善。

2.3 马铃薯病毒病检测标准

马铃薯病毒检测技术标准涉及9种病毒，共10个标准（表4）。《脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程》（NY/T 401-2000）中规定了PVY、PVA、PVX、PVM、PVS和PLRV 6种病毒的血清学检测方法，结果判定为（检测样品OD405）/（阴性对照OD405）≥2时，样品为阳性。该方法适用于大田样品检测。具有一次性检测样品量大、操作简单、实验条件要求低等特点，但在试管苗检测时，由于DAS-ELISA 检测灵敏度和试管苗本身浓度低的原因，可能会出现漏检。

表4 马铃薯病毒病检测标准Table 4 Detection standard of potato viruses

由于PVA是检疫性病害，检疫部门制定了《马铃薯A病毒检疫鉴定方法》（SN/T 1135.7-2009）[11]和《马铃薯A病毒检疫鉴定方法纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法》（GB/T 28974-2012）[12]。其中检疫行业标准中规定了生物学、DAS-ELISA和RT-PCR检测方法，并且规定当DAS-ELISA检测结果为阳性时，需要生物学或是RT-PCR 检测结果亦为阳性的样品，才能判定为含有PVA病毒。国际标准中规定采用免疫胶体金的方法进行检测，在结果判定上同样需要生物学或是RT-PCR检测结果亦为阳性的样品，才能判定样品中含有PVA病毒。

《马铃薯卷叶病毒检疫鉴定方法》（SN/T 2627-2010）[13]和《马铃薯M病毒检疫鉴定方法》（SN/T 1135.12-2015）[14]规定DAS-ELISA和RT-PCR检测方法。其中，有一种方法检测结果为阳性即可判定为样品含有卷叶病毒；若结果均为阴性，样品中不含PVM，DAS-ELISA 检测为阳性或疑似阳性的样品，需经RT-PCR检测为阳性，且测序结果为目的片段的样品判定为含有PVM病毒。

《马铃薯Y 病毒检疫鉴定方法》（SN/T 1135.13-2015）[15]规定DAS-ELISA、胶体金免疫层析法、RT-PCR检测方法、qRT-PCR、免疫电镜和生物学方法。结果中无可疑症状的样品，通过血清学或分子生物学任意一项检测结果为阴性，则判断样品不带PVY；若有可疑样品，通过血清学或分子生物学方法任意2项检测结果为阴性时，则判定样品中不带PVY。免疫学原理的一种，分子生物学原理的一种和免疫电镜，任意2 种方法检测为阳性的，则样品含有PVY。免疫学原理的一种或分子生物学原理任意一种检测结果为阳性，并通过生物学检测表现为叶脉坏死的阳性样品，则判断含有PVYN株系。该标准中检测方法比较全面，但结果判定较为繁琐，通常情况下非检疫性病害，应用除生物学方法外的一种检测技术即可判定结果。

《马铃薯6 种病毒的检测RT-PCR 法》（NY/T 2678-2015）[16]规定了PVY、PVA、PVX、PVM、PVS和PLRV 6种病毒单重和多重检测程序，该标准应用通用反应程序，检测病毒种类时仅需要调整引物和水的体积即可，简单方便，通量大，灵敏度高，适合检测试管苗和薯块样品。电泳检测结果中若出现目的片段，即可判定为阳性样品。

《马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法》（SN/T 1135.2-2003）[17]规定了关于生物学、血清学和电镜的检测方法，检测结果中若植株或薯块具有典型症状、病毒粒子典型形态、血清学检测为阳性和生物测定鉴别寄主典型症状的样品，判定样品含有马铃薯黄化矮缩病毒。该标准在结果判定上要求较为严格，一般实验室很难同时满足条件，因此在实际检测操作中一般可以采用血清学方法检测判定结果，如需确定则需送检疫部门测定。

《马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法》（SN/T 1135.3-2003）[18]规定了生物学、血清学、电子显微镜技术和分子生物学的相关方法，结果判定为薯块和病株样品症状具有典型病害症状，血清学检测和RT-PCR检测结果均为阳性，且生物学检测鉴别寄主产生典型症状的样品，即可以判定含有马铃薯帚顶病毒。

《马铃薯V 病毒检疫鉴定方法》（GB/T 31806-2015）[19]规定了DAS-ELISA 方法、RT-PCR、qRT-PCR和生物学检测方法，结果判定除生物学方法外，检测的样品呈阴性时则样品中不含PVV 病毒，样品经DAS-ELISA检测为阳性，分子生物学检测也为阳性的样品即可以判定为样品含PVV病毒。

马铃薯病毒检测标准中均涉及血清学方法，目前该方法已得到广泛推广，具有操作简单，检测通量大等特点。因此，建议在实际检测工作中，大田样品采用灵敏度、特异性较好的DAS-ELISA方法检测。而分子生物学方法具有一次性检测病害种类多、灵敏度高的特点，适合检测试管苗样品和块茎样品，以及验证DAS-ELISA检测的临界值样品。检测试管苗样品时如果出现临界值样品时，需要启动RT-PCR验证。免疫胶体金检测方法适合大田样品现场检测，但试纸条价格较高，目前不能实现大面积应用。电镜检测法实验室大多不具备设备条件，而且在检测时极容易漏检。生物学方法则检测周期长，需要温室等隔离条件，实际操作性不强。因此，建议在日常检测工作中可以采用DAS-ELISA和RT-PCR检测方法，判定检测结果。

2.4 真菌性病害检测标准

7种真菌性病害的检测标准均为检疫部门提出（表5），其中，银屑病、黑粉病、坏疽病、皮斑病和癌肿病均为检疫性病害，对产业危害较重。

《马铃薯银屑病菌检疫鉴定方法》（GB/T 28093-2011）[20]、《马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法》（SN/T 1135.4-2006）[21]、《马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法》（SN/T 1135.8-2009）[22]和《马铃薯绯腐病菌检疫鉴定方法》（SN/T 1135.6-2008）[23]均规定采用生物学方法检测，若样品具有典型的病害症状、病原菌形态和培养特征，则判定为阳性样品。《马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法》（SN/T 2729-2010）[24]和《马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法》（SN/T 1135.11-2013）[25]除规定采用生物学方法检测外，还规定了PCR 和测序方法，其中，SN/T 2729-2010结果判定规定若样品具有典型的病害症状、病原菌形态和培养特征，或培养后获得的样品经过PCR检测，可以得到目的片段的样品均为马铃薯炭疽病菌阳性样品。而SN/T 1135.11-2013 规定样品具有典型的病原菌形态特征，并经过PCR检测或测序检测为马铃薯皮斑病阳性的样品。《马铃薯癌肿病检疫鉴定方法》（SN/T 1135.1-2002）[26]和《马铃薯种薯产地检疫规程》（GB 7331-2003）[27]都规定了采用镜检的方式进行检测，检疫行业标准中还规定了病害引起的生物学症状判定方法。

表5 马铃薯真菌性病害检测标准Table 5 Detection standard of potato fungal diseases

表6 马铃薯甲虫检测标准Table 6 Detection standard of colorado potato beetle

表7 马铃薯线虫检测标准Table 7 Detection standard of potato nematodes

马铃薯真菌病害相对容易识别，发病症状典型，所以检测中多以典型的病害症状及真菌的生物学特征进行检测和结果判定，在特殊条件下，有些病害也可能潜隐在样品中，不容易直接目测判断，造成漏检，因此也需要进一步完善PCR检测技术，补充生物学检测的不足。同时，一些常见的真菌病害，如晚疫病、早疫病、黑痣病、枯萎病和粉痂病等病害，通常也是应用生物学方法鉴定，但在检测工作中还缺少相应的检测标准支持，有待补充完善。