探究Eph受体A2在结直肠癌细胞化疗耐药中的作用及相关机制

洪钟时 邱成志 王春晓 唐龙锋 庄海滨 施泽生

福建医科大学附属第二医院普通外科 (福建 泉州 362000)

肿瘤细胞的耐药性主要为长期治疗下的获得性化疗耐药，此种棘手的关系与人Rph受体A2基因有着密切的相关性，针对结直肠癌肿瘤细胞耐药的研究可以从人Rph受体A2基因入手，其对接示结直肠癌肿瘤细胞耐药机制以及如何避免耐药、优化化疗方案等有重要意义[1-2]。为此，本文通过选择选择中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供的人结直肠癌细胞株、结肠耐药细胞株进行实验，旨在为临床优化结直肠癌细胞化疗方案、降低耐药发生率提供实验参考依据。具体报告如下。

1 对象和方法

1.1对象 选择中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供且本实验室自行传代冻存的人结直肠癌细胞株、结肠耐药细胞株。RPMI-1640 培养基(购自北京索莱宝科技有限公司)、Optu-MEM培养基(上海歌凡生物科技有限公司)。胎牛血清(购自Gibco公司。β-联蛋白购自上海源叶生物科技有限公司。神经钙黏素、波形蛋白(品牌：Gibco，产地：美国)。Notch、Snail 及 β-actin 抗体购自宝日医生物技术北京有限公司。CCK-8 细胞活力及增殖检测试剂盒购自美国Sigma公司。EphA2 siRNA 及其阴性对照 siRNA 购自上海研谨生物科技有限公司。倒置相差显微镜 购自Peprotech 公司。7500型实时荧光定量 PCR 仪购自上海研生实业有限公司。Matrigel、Transwell 小室均购自美国BD Biosciences公司。

1.2方法 本研究细胞总RNA抽提根据Trizol一步法进行操作。

(1)首先采用含有10.0%新生小牛血清RPMI-1640 培养基并将人结直肠癌细胞株、结肠耐药细胞株置于37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养。按照研究中的方法进行换液、胰酶传代、Real-time PCR 检测 mRNA 的表达(反向引物为 5’-TCAGACACCTTGCAGAC-CAG-3’；β-actin 作为内参照，正向引物为 5’-ACA-GAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3’，反向引物为5’-ATCCTTCTGACCCATGCCCACCA-3’)、构建 PCR 反应体系、分析mRNA相对表达量。

(2)CCK-8法：加入不同浓度5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康检测同步化已90%融合的人结直肠癌细胞株、结肠耐药细胞株，统计其对化疗药物的敏感性(以半数抑制浓度IC50表示)。同时统计干扰EphA2的表达后统计人结肠耐药细胞株对5-氟尿嘧啶、奥沙利铂的耐药性。

(3)进行siRNA转染，待人结直肠癌细胞株、结肠耐药细胞株生长70%融合后同步化处理以及siRNA转染。通过制作 Eph受体A2siRNA转染组、空白组、siRNA阴性组，将其溶解Optu-MEM培养基。孵育后将三组转染混合物加入人结直肠癌细胞株、结肠耐药细胞株。对其放置细胞培养箱、正常培养基进行培养，提取细胞蛋白测定转染效率进行分析。统计结直肠癌亲本细胞株、结肠耐药细胞株中 Eph受体A2siRNA表达水平，同时在结直肠癌亲本细胞株中不断提高5-FU浓度，统计 Eph受体A2siRNA表达。

(4)利用划痕实验、倒置相差显微镜观察在干扰 Eph受体A2后人结直肠癌细胞株、结肠耐药细胞株的自我修复。Transwell实验观察人结直肠癌细胞株、结肠耐药细胞株染色后的数目(每组细胞包括3个视野，记录其平均值)。

1.3统计学方法 人结直肠癌细胞株、结肠耐药细胞株采用的所有数据均采用SPSS21.0软件进行分析。半数抑制浓度IC50以Mean±SD表示，同时此类计量资料采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1结直肠癌耐药细胞株、亲本株化疗耐药性、交叉耐药性分析 CCK-8法检测结果得出结肠癌耐药细胞株与亲本细胞株的半数抑制浓度IC50，两者相比较，结肠癌耐药细胞株的半数抑制浓度优于亲本株，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2Eph受体A2与结直肠癌细胞化疗耐药关系分析 结肠癌亲本细胞株Eph受体A2蛋白表达水平(1.08±0.73)，结肠癌耐药细胞株Eph受体A2蛋白表达水平(2.57±0.81)差异有统计学意义(t=6.843，P=0.000)。此外5-氟尿嘧啶0mg/L时亲本细胞株中Eph受体A2蛋白表达水平为(0.9±0.5)，5-氟尿嘧啶5mg/L时Eph受体A2蛋白表达水平为(1.2±0.7)，10mg/L时Eph受体A2蛋白表达水平为(1.9±0.8)，呈逐渐增加的水平。这两项研究结果提示Eph受体A2可调控结直肠癌细胞化疗耐药性。

表1 结直肠癌耐药细胞株、亲本株化疗耐药性、交叉耐药性统计结果

2.3Eph受体A2干扰后对结直肠癌细胞的影响 低倍显微镜(1X00)可发现干扰Eph受体A2蛋白表达水平后细胞数量在6h、12h无明显变化，而在48h细胞壁附着能力明显下降。

3 讨论

近年来，有诸多研究表明多种因子可介导Notch信号通路在肿瘤细胞增殖中发挥重要的调节作用，其包括Notch-1蛋白、人Rph受体A2基因等[3]。虽然临床研究证实了人Rph受体A2基因与多种肿瘤病变的相关性，但关于探究Eph受体A2在结直肠癌细胞化疗耐药中的作用及相关机制的研究较少，这值得前瞻性研究深入调查[4]。

人Rph受体A2基因定位于1p36.1，有研究表明Eph基因家族是受体络氨酸激酶中最大的亚族[5]。人Rph受体A2基因广泛参与炎症反应、肿瘤细胞增殖、肿瘤血管形成等病理生理过程，且在结直肠癌的病理生理过程中，人Rph受体A2基因对结直肠癌肿瘤细胞迁移、耐药性增加和生长分化等诸多生理学过程发挥了重要作用，其表达水平与肿瘤造成的内外微环境有一定相关性[6-7]。有研究中通过人Rph受体A2基因沉默基因抑制Rph受体A2基因表达，然后观察发现结肠癌细胞的增殖能力显著降低，这证实了人Rph受体A2基因促使肿瘤细胞迁移等作用[8]。因此临床研究认为人Rph受体A2基因通过介导Notch信号通路诱导肿瘤细胞增殖，并且内皮细胞衰老以及发挥促进肿瘤血管生成能力[9-10]。本次研究结果表明结肠癌耐药细胞株中人Rph受体A2基因表达水平高于亲本细胞株，且亲本细胞株中人Rph受体A2基因随着5-氟尿嘧啶剂量逐渐增加，其表达水平也明显向升高，这表明人Rph受体A2基因具有促进结肠癌耐药性增加的作用，这可能与人Rph受体A2基因介导Notch信号通路，促使肿瘤细胞获得间充质样特性，与此同时结肠癌肿瘤细胞也失去了上皮样特性，此过程被称为EMT，人Rph受体A2基因与其密切相关[11-12]。

综上所述，人Rph受体A2基因可增加结直肠癌肿瘤细胞耐药性，这可能与EMT有关。值得临床重视。