针刺对自发性高血压大鼠心肌ANP、ACE2表达和Ang（1-7）/AngⅡ 比值的影响

纪智　袁静云　王紫娟　张跃　梁靖蓉　吴娇娟　刘清国

[摘要] 目的 通过观察自发性高血压大鼠（SHR）心肌组织结构和肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAS）作用因子表达的变化，探究针刺对高血压心肌肥厚的防护机制。 方法 将10只WKY大鼠作为空白组，将20只SHR按照随机数字表法分为模型组和针刺组，每组各10只。所有大鼠均为10周龄SPF级雄性大鼠。适应性饲养1周后，针刺组大鼠用毫针于“百会”和双“太冲”直刺，每天1次，连续干预28 d。模型组和空白组不做针刺干预。于实验第1、7、14、21、28天针刺前测量血压值。实验结束后称取大鼠全心及左心室重量，并計算心脏重量指数（HWI）和左心室重量指数（LVWI）。应用HE和Masson染色法观察心肌组织形态，并通过Real-tiem PCR、Western blot、酶联免疫吸附测定（ELISA）等技术检测各组大鼠心肌组织中心房钠尿肽（ANP）、血管紧张素转换酶2（ACE2）、血管紧张素1-7[Ang（1-7）]和AngⅡ的表达，并计算Ang（1-7）/AngⅡ。 结果 与空白组比较，模型组大鼠收缩压（SBP）、HWI、LVWI显著升高（P < 0.01）。与模型组比较，针刺组大鼠SBP、HWI、LVWI值明显降低（P < 0.05或P < 0.01）。病理切片结果显示，与空白组比较，模型组大鼠心肌细胞的细胞体积明显变大，且排列相对紊乱，同时细胞间距变宽，充斥着大量被蓝染的纤维。与模型组比较，针刺组大鼠心肌细胞体积更小，细胞间距更窄，细胞间隙蓝染的纤维变少。与空白组比较，模型组心肌组织的ACE2的表达水平和Ang（1-7）/AngⅡ显著降低（P < 0.01），ANP的表达水平升高（P < 0.01）。与模型组比较，针刺组ACE2的表达水平和Ang（1-7）/AngⅡ的比值显著升高（P < 0.01），ANP的表达水平降低（P < 0.01）。 结论 针刺“百会”“太冲”可通过调节ACE2/Ang（1-7）的表达，有效降低SHR血压，并减轻其心肌肥厚的程度。

[关键词] 高血压;针刺;心肌肥厚;血管紧张素转换酶2;血管紧张素1-7

[中图分类号] R544.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）06（b）-0004-05

Effect of acupuncture on the expression of ANP， ACE2 and Ang（1-7）/ AngⅡ ratio in heart tissue of spontaneously hypertensive rats

JI Zhi   YUAN Jingyun   WANG Zijuan   ZHANG Yue   LIANG Jingrong   WU Jiaojuan   LIU Qingguo

School of Acupuncture and Massage， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing   100029， China

[Abstract] Objective To investigate the protective mechanism of acupuncture on myocardial hypertrophy by observing the changes of myocardial tissue structure and renin angiotension system （RAS） system action factor expression in spontaneously hypertensive rats （SHR）. Methods Ten Wistar Kyoto rats （WKY） were selected as normal control group， 20 SHRs were divided into model group and acupuncture group by random number table method， with 10 rats in each group. All rats were SPF grade male 10-week-old rats. After one week of acclimatization， acupuncture was applied on Taichong （LR3） and Baihui （DU20） of SHRs in acupuncture group once a day for 28 days. The other two groups only received the same grasping and fixation stimulation. Blood pressure was measured before acupuncture on day 1， 7， 14， 21 and 28. At the end of the experiment， the weight of the whole heart and left ventricle of the rats were weighed， and ratio of left ventricle weight to body weight （LVWI）， heart weight index （HWI） were calculated. HE and Masson staining method were applied to observe the myocardial tissue morphology， and Real-time RCR， Western blot， enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect the expression of atrial natriuretic peptide （ANP）， angiotensin-converting enzyme 2 （ACE2）， angiotensin （1-7） [Ang（1-7）]， AngⅡ and Ang（1-7）/AngⅡ， as well as the underlying mechanisms were investigated. Results Compared with normal control group， the systolic blood pressure （SBP）， HWI and LVWI in the model group were significantly increased （P < 0.01）. Compared with the model group， SBP， HWI and LVWI values in the acupuncture group were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）. The pathological results showed that compared with normal control group， the cell volume of rat cardiac muscle cells in the model group was significantly larger， and the arrangement was relatively disordered. Meanwhile， the cell spacing was widened， and there were a lot of blue-stained fibers. Compared with the model group， the cardiac muscle cells in the acupuncture group were smaller in volume， narrower in cell spacing， and fewer blue-stained fibers in the cell space. Compared with normal control group， the expression level of ACE2 and Ang （1-7）/AngⅡ of myocardial tissue in model group significantly decreased （P < 0.01）， the expression level of ANP significantly increased （P < 0.01）. Compared with model group， the expression level of ACE2 and Ang （1-7）/AngⅡ in acupuncture group significantly increased （P < 0.01）， the expression level of ANP significantly decreased （P < 0.01）. Conclusion Acupuncture at LR3 and DU20 could reduce blood pressure and inhibit the development of cardiac hypertrophy， which might be mediated by the regulation of ACE2/Ang（1-7） pathway.

[Key words] Hypertension; Acupuncture; Myocardial hypertrophy; Angiotensin-converting enzyme 2; Angiotensin （1-7）

高血压病患者的心脏损伤往往开始于病理性心肌肥厚，长时间的压力負荷往往引起心肌细胞的肥大[1-2]。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin system，RAS）在调节血压、维持心肌正常结构功能等方面具有极其重要的作用。血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）和血管紧张素1-7[angiotensin（1-7），Ang（1-7）]是RAS系统中起降压作用的一条轴线，对心血管系统起到保护作用[3]。研究表明，针刺可降低血压，改善心肌肥厚，预防其并发症[4-5]。本研究通过观察针刺对自发性高血压大鼠（SHR）血压和心肌肥厚程度及对ACE2/Ang（1-7）轴表达的影响，探究针刺调控的内在机制，以期为高血压和心肌肥厚的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取SPF级10周龄雄性SHR大鼠20只，体重200～230 g，雄性Wistar-Kyoto（WKY）大鼠10只，体重220～240 g，均购自北京维通利华实验动物养殖中心，实验动物许可证号：SCXK（京）2012-0001。本研究中有所有对动物进行的操作，均符合北京中医药大学伦理委员会的规定。

1.2 仪器与试剂

无创式动物尾压测量仪（XH200，北京众实科技有限公司）;韩氏电针仪（LH200H，南京济生医疗科技有限公司）;汉医牌针灸针（7 mm×0.13 mm，北京汉医医疗器械中心）;超薄切片机（Leica UC7，德国徕卡公司）;正置光学显微镜（BX53，日本Olympus公司）;精密电子称（ME104E，梅特勒托利多上海有限公司，精度1/10 000）;高速冷冻离心机（E3116R，美国安胜）;电泳仪（DYCP-31E，北京六一厂）。逆转录试剂盒TIANScript RT Kit（北京天根生化科技有限公司）;Trizol试剂（15596026，美国Invitrogen生命技术科技有限公司）;BCA蛋白测定试剂盒（02912E，北京康为世纪生物科技有限公司）;ACE2抗体（ab108252，英国Abcam公司）;心房钠尿肽（ANP）酶联试剂盒（E02A0 493，上海蓝基生物科技有限公司）;Ang（1-7）酶联试剂盒（E02 A0206，杭州联科生物技术有限公司）;AngⅡ酶联试剂盒（E02A0204，杭州联科生物技术有限公司）;4%多聚甲醛（BL53 9A，合肥新恩源生物科技有限公司）;Masson染液套装（G1006，武汉赛维尔生物科技有限公司）;HE染液（G1005，武汉塞维尔生物科技有限公司）。

1.3 实验方法

将10只WKY大鼠作为空白组，以随机数字表法将20只SHR大鼠分为模型组和针刺组，每组各10只，适应性饲养1周后开始实验。每天上午固定时间对针刺组大鼠进行干预：参照大鼠标准穴位图谱[6]将毫针刺入大鼠“百会”和双侧“太冲”，深度1～2 mm，行捻转手法（60次/min）平补平泻1 min，留针19 min。每天上午针刺1次，连续28 d。模型组和空白组不进行针刺干预，仅进行相同的抓取固定刺激。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 血压测量  测量血压前先将大鼠放入无创血压仪的电热鼠笼中，于37℃下预热约15 min后开始加压，连续测量3次大鼠尾动脉收缩压（SBP）并取其平均值。于实验第1、7、14、21、28天针刺干预前测量血压值，共5次。

1.4.2 心脏重量指数（HWI）和左心室重量指数（LVWI） 取材前先称取大鼠体重。将大鼠心脏取出后，迅速以生理盐水洗净并吸干其表面液体。在冰上去除心脏周围大血管和组织后称取其重量，以心脏重量与体重的比值作为HWI（mg/kg）。然后沿室间切取左心室称重，左心室与体重的比值即为LVWI（mg/kg）。

1.4.3 HE和Masson染色观察心肌组织形态  每组大鼠中随机选取4只，取其心脏后于4%多聚甲醛中固定12 h，然后进行染色。HE染色：依次将组织进行脱水、包埋、脱蜡等操作后，切成4 μm切片并烘干，然后用苏木精-伊红染液染色，脱水后以二甲苯透明树胶封片。Masson染色：依次将切片置于铁苏木精-丽春红、磷钼酸、苯胺蓝染液浸染后脱水封片。通过光学显微镜观察不同组别大鼠心肌组织形态的差异。

1.4.4 检测心肌组织ANP、ACE2、Ang（1-7）和AngⅡ的表达水平  将每组剩余6只大鼠的心脏取出后迅速用液氮冷冻，然后存放于-80℃冰箱中，以备Real-time PCR、Western blot和酶联免疫吸附测定法（ELISA）使用。

Real-time PCR检测ANP、ACE2的基因表达：在50 mg心脏组织中加入1 mL Trizol，在液氮条件下进行研磨并提取总RNA。取8 μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳。然后按照TIANScript反转录试剂盒的使用说明反转录为cDNA。通过NCBI-Primer3设计引物，并用ABI7500 PCR仪进行扩增（ANP：上游GCTAG-ACCACCTGGAGGAGA，下游GTTGACTTCCCCAGTC-CAGG，扩增长度136 bp;ACE2：上游GAGGAAAAGGCCGAGAGCTT，下游GACGCTTGATGGTCGCATTC，扩增长度223 bp;内参GAPDH：上游GACTCTACCCACGGCAAGTT，下游GGTGATGGGTTTCCCGTTGA，扩增长度78 bp）。扩增完成后60℃开始升温，通过熔解曲线验证扩增产物的特异性是否良好，并通过软件分析得到Ct值。大鼠心脏组织中ACE2和ANP基因的相对表达量以2-△△Ct的方式进行计算。

Western blot检测ACE2的蛋白表达：在50 mg心脏组织中加入500 μL裂解液，液氮条件研磨并提取总蛋白，按照BCA蛋白定量试剂盒的使用说明进行蛋白定量，然后将蛋白按照10 μL/孔进行上样，电泳转膜过后，用5%脱脂奶粉封闭孵育1 h。一抗稀释（1∶1000）后置于4℃冰箱孵育过夜。第2天以TBST洗涤3次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000），然后在室温下摇床孵育40 min。TBST洗膜3次后，滴加ECL并静置3 min后曝光显影，使用Gel Image system ver.4.00软件对所得条带进行分析，计算其灰度值，内参为GAPDH。

ELISA法检测ANP、Ang（1-7）和AngⅡ的蛋白表达：以3000 r/min（离心半径13.5 cm）将心肌组织离心匀浆，10 min后取上清液，分装后-20℃保存备用。严格按ELISA试剂盒说明书检测心肌组织匀浆中ANP、AngⅡ和Ang（1-7）的蛋白含量。

1.5 统计学方法

运用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，不同组间比较采用单因素方差分析，两组之间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血压比较

模型组大鼠SBP始终显著高于空白组（P < 0.01），而针刺治疗28 d后针刺组SBP显著低于模型组（P < 0.01）。见图1。

与空白组比较，△P < 0.01;与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。SBP：收缩压;1 mmHg=0.133 kPa

2.2 各组大鼠LVWI和HWI比较

模型组大鼠LVWI、HWI明显高于空白组（P < 0.01），而针刺组LVWI、HWI显著低于模型组（P < 0.01）。见图2。

与空白组比较，△△P < 0.01;与模型组比较，**P < 0.01。LVWI：左心室重量指数;HWI：心脏重量指数

2.3 各组大鼠心肌组织形态比较

与空白组比较，模型组大鼠的心肌细胞体积明显变大，细胞核增大深染。细胞之间距离变宽，且细胞间充斥着大量蓝染的胶原纤维。与模型组比较，针刺组大鼠心肌细胞体积更小，细胞间距更窄，且细胞间隙蓝染的胶原纤维更少。见图3。

2.4 各组大鼠心肌组织ANP、ACE2、Ang（1-7）和AngⅡ表达水平比较

与空白组比较，模型组大鼠心肌组织中ACE2、Ang（1-7）的表达水平及Ang（1-7）/AngⅡ的比值显著降低（P < 0.01），ANP和AngⅡ的表达水平显著升高（P < 0.01）。而与模型组比较，针刺组大鼠心肌组织中ACE2、Ang（1-7）的表达水平及Ang（1-7）/AngⅡ的比值显著升高（P < 0.01），ANP和AngⅡ的表达水平显著降低（P < 0.01）。见图4。

3 讨论

长期的高血压会导致心肌肥厚，进入失代偿期则会大大提高心力衰竭的发病风险[7]。因此控制血压和逆转左室肥厚，对预防严重心血管系统疾病具有重要意义。根据中医理论，高血压多因为肝阳上亢而起[8]，发病日久则导致阴阳失调，气血逆乱，瘀浊阻心而引起心肌肥厚[9]。本研究选用太冲穴为肝经原穴、百会为诸阳之会。两穴合用有平肝降气、调和阴阳、祛瘀化浊之效。诸多研究显示，针刺太冲、百会均可明显降低血压，抑制心肌肥厚的发展[10-11]。本研究结果与以上研究一致：模型组大鼠SBP和LVWI、HWI等指标均明显高于空白组，形态学观察也表现出明显的心肌肥厚趋势。而针刺组经过28 d治疗后，以上指标有显著改善，提示针刺可有效降低SHR的血压，遏制其心肌肥厚的发展。

病理性心肌肥厚常伴有间质纤维化和血管周围纤维化，并伴有细胞凋亡和ANP的释放，故ANP常被作为心肌细胞肥厚的反应指标[12]。研究表明自发性高血压大鼠的心脏中ANP的表达水平比正常大鼠高50%～70%，并且随着其年龄的增长和血压的升高，其心脏中ANP表达水平也随之升高[13]。研究表明Ang、抗利尿激素和肾上腺皮质激素等均可以促进ANP释放[14]。RAS系统存在两条相互拮抗的轴线，即ACE/AngⅡ和ACE2/Ang（1-7）。正常状态下两者相辅相成，制约平衡，共同维持心血管系统的稳定[15]。研究表明，ACE2可有效抑制病理性肥厚、心肌纤维化和心功能不全[16-17]。ACE2可将AngⅡ转化为Ang（1-7），从而降低AngⅡ浓度，增大Ang（1-7）/AngⅡ比值[18]。Ang（1-7）的作用与AngⅡ相反，可扩张血管，降低动脉压，还可抑制AngⅡ介导的心肌重构作用[19-20]。

本研究结果亦显示针刺“百会”“太冲”，在降低血压和抑制心肌肥厚发展的同时，可显著提高SHR大鼠心肌组织中ACE2和Ang（1-7）的表达水平，降低AngⅡ和ANP的表达水平。提示针刺可通过激活ACE2/Ang（1-7）轴，降低血压，抑制心肌肥厚的发展。高血压和心肌肥厚的形成是一个受多因素影响的复杂过程，本研究着重关注了针刺通过调节RAS系统对高血压心肌肥厚起到的作用，尚有一定的局限性。接下来的研究中将对针刺调节血压和逆转心肌肥厚的其他可能途径及其内在机制做更全面的探索。

[参考文献]

[1]  吴小龍，薛明明，司明明，等.心肌肥厚发生机制及药物治疗的研究进展[J].医学综述，2015，21（5）：803-806.

[2]  Draper TS，Silver JS，Gaasch WH. Adverse Structural Remodeling of the Left Ventricle and Ventricular Arrhythmias in Patients With Depressed Ejection Fraction [J]. J Card Fail，2015，21（2）：97-102.