脑脉醒神胶囊提取工艺研究

张 瑜，曾聪彦，卓 斌，胡玉良，肖凌婷，辛晓芳，董杰英

（广州中医药大学附属中山中医院，广东中山528400）

脑脉醒神胶囊是在我院临床使用多年的有效经验方基础上制成的医院制剂（粤药制字Z20130020），由大黄、桃仁、红花、丹参、黄芩、栀子、厚朴、法夏、茯苓、胆南星、竹茹等中药组成，其中大黄有泻下通腑兼活血化瘀之功，为方中君药，与桃仁、红花、丹参等臣药相伍，使诸药活血化瘀开窍之功大显其威，使“血瘀”遁去；痰、瘀、热内结，壅于肠腑，致腑气不通、燥屎内结，因此大黄与厚朴、芒硝成大承气汤，直清阳明腑实，推陈出新；石菖蒲芳香辟秽，通窍醒神助麝香通诸窍；法半夏、胆南星、茯苓、竹茹健脾化痰开窍醒神；黄芩、山栀性辛凉苦寒，清热凉血化瘀，除三焦之热；诸药合用共奏活血化瘀、化痰开窍、通腑泻热、开窍醒脑之功［1]。根据脑脉醒神胶囊方中各药有效成分及性质进行分析，同时考虑医院中药制剂生产的特点，配制工艺采用君药大黄醇提，有利于提取大黄蒽醌类成分［2-3]，其余药味桃仁、红花、丹参、黄芩、栀子、厚朴等采用水提的方法。以上主要药味醇提、水提工艺的合理与否将直接影响成品质量，进而影响临床疗效，故本文对大黄醇提及其余药味水提工艺进行了研究，筛选出合理可行的提取工艺。

1 材 料

Agilent 1236型高效液相色谱仪（美国安捷伦）；UV2550紫外可见分光光度计（日本岛津）；BS-224S型电子天平（德国赛多利斯）；HH-S4数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；东方-A型直热式电热恒温干燥箱（广州东方电热干燥设备厂）；大黄素对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号110756-200110），苦杏仁苷对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号 110820－201607）；大黄、桃仁、红花、丹参、黄芩、栀子、厚朴、法夏、茯苓、胆南星、竹茹等药材均购于广东广弘药材有限公司，经广州中医药大学附属中山中医院梅全喜教授鉴定，均符合《中国药典》2015年版各药材项下规定，甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 大黄醇提工艺研究

2.1.1 大黄总蒽醌含量的测定［4－5]

2.1.1.1 对照溶液的制备 精密称取大黄素对照品5.26mg，加0.8%醋酸镁甲醇液溶解并定容至50mL，即得大黄素对照液（0.105 2mg/mL）。

2.1.1.2 供试品溶液的制备 精密吸取各号提取液 1 mL，水浴挥干，加冰醋酸－25%盐酸（10∶21）15 mL使溶解，沸水浴中回流1 h，立即置冰水浴中冷却，用乙醚萃取5次，15mL/次，合并萃取液，加无水硫酸钠脱水后，滤过，挥干，加0.8%醋酸镁甲醇液溶解，转移至25mL量瓶中，用0.8%醋酸镁甲醇液定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.1.3 最佳测定波长的确定 取大黄素对照液适量，水浴挥干，以0.8%醋酸镁甲醇溶液溶解残渣并定容至10 mL，摇匀；以0.8%醋酸镁甲醇溶液作参比溶液，在400～600 nm波长范围内分别对大黄素对照液和供试品溶液进行扫描，两者在505 nm处均有最大吸收，故选择505 nm作为测定波长。结果见图1。

图1 大黄素吸收光谱图

2.1.1.4 标准曲线的制备 分别精密吸取大黄素对照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 置蒸发皿中，挥干，以0.8%醋酸镁甲醇溶液洗涤残渣，定容至25mL，摇匀。以醋酸镁甲醇溶液为空白，在505 nm测定吸收度（A），以大黄素对照液浓度（μg/mL）为横坐标（X），吸收度（A）为纵坐标（Y），绘制标准曲线，回归方程为：Y=24.42X－0.865，r=0.998 7。结果表明大黄素对照液浓度在4.208～42.08μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.2 单因素试验

2.1.2.1 乙醇浓度考察 取大黄药材饮片100 g，共4份，分别加8倍量对应浓度乙醇溶液（30%、50%、70%、90%），加热回流提取 30min，滤过，减压浓缩并定容至100mL，即得。照大黄总蒽醌含量测定法进行测定。结果见表1。

表1 乙醇浓度单因素考察结果

从表1中可以看出，随着乙醇浓度的增加，大黄总蒽醌含量逐渐增高，乙醇浓度为70%时总蒽醌含量有最大值，因此，大黄回流提取法乙醇浓度以70%左右为宜。70%乙醇浓度可以是60%，也可以是80%，因此，选择还需60%、70%、80%这3个浓度水平进一步安排正交考察。

2.1.2.2 提取时间考察 取大黄药材饮片100 g，共4份，加70%乙醇8倍量，加热回流提取10、30、50、70min，滤过，减压浓缩并定容至100mL，即得。照大黄总蒽醌含量测定法进行测定。结果见表2。

表2 提取时间单因素考察结果

从表2中可以看出，随着提取时间的增加，总蒽醌的浓度逐渐增大，当提取时间为30 min，提取较充分，与50min和70min两组相比，相差不大。因此，大黄回流提取时间确定为30min。

2.1.2.3 乙醇用量考察 取大黄药材饮片100 g，共 4 份，分别加 70%乙醇溶液 4、6、8、10 倍量，加热回流提取30min，滤过，减压浓缩并定容至100mL，即得。照大黄总蒽醌含量测定法进行测定。结果见表3。

表3 乙醇用量单因素考察结果

从表3中可以看出，随着加液倍量的增加，总蒽醌的浓度逐渐增大，当加液倍量为8倍量时，提取较充分，与10倍量相比，相差不大，可对其做进一步的正交考察。

2.1.3 正交试验 在单因素试验的基础上，本试验采用正交试验优化提取工艺，选取乙醇浓度（A），提取次数（B），乙醇用量（C）作为考察因素，各取3水平，进行L9（34）正交试验，筛选最佳工艺条件。以大黄总蒽醌的提取率为考察指标，筛选最佳醇提工艺。因素水平见表4，实验方案及结果见表5。

表4 因素水平表

表5 试验安排及结果

方差分析结果见表6。

表6 方差分析结果

对大黄总蒽醌提取工艺的数据进行直观分析（表 5），可知，影响因素顺序为 B＞A＞C，即提取次数对大黄总蒽醌提取率影响最大，其次为乙醇浓度，再次为乙醇用量，最佳提取工艺组合为A2B3C3。由表6可见，因素B（提取次数）各水平之间有显著差异（P＜0.05），因素 A（乙醇浓度）和因素 C（乙醇用量）各水平间无显著性差异（P ＞0.05）。鉴于C（乙醇用量）对提取效果无显著性影响，为降低成本，将C3改为C2，由此确定大黄总蒽醌最佳提取工艺为A2B3C2，结合单因素提取时间考察结果，得出大黄最佳醇提工艺为药材饮片加70%乙醇6倍量，加热回流提取3次，每次30min。

2.1.4 验证试验 为确定该工艺的优劣和稳定性，据所筛选的最佳条件，验证3批，结果见表7。由表可知，验证试验结果与正交试验优选结果吻合，说明正交试验选出的工艺条件合理，工艺条件稳定可行。

表7 提取工艺验证试验结果

2.2 水提工艺研究

2.2.1 因素与考察指标确定 依据中药水提经验，确定提取次数、提取时间、加水倍量等为水提效果的主要因素，以方中药材中主要指标成分苦杏仁苷提取率和干膏得率为考察指标，采用单因素试验方法进行试验。

2.2.2 样品的制备 按处方比例称取1/20处方量的桃仁、红花、丹参、黄芩、栀子、厚朴、法夏、茯苓、胆南星、竹茹等药味，按实验设计的方法进行提取，滤过，滤液浓缩并定容至250mL，备用。

2.2.3 总固体物的测定 精密吸取各样品浓缩液20 mL，至已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，照干燥失重法（中国药典2015年版四部通则0831）测定，计算干膏得率，公式如下：

W为20 mL浓缩液中干浸膏重量，V为定容体积，Wt为药材重量。

2.2.4 苦杏仁苷的含量测定

2.2.4.1 色谱条件［6]色谱柱：Kromasil 100－5 C18柱（4.6×250mm，5 μm）；流动相：水－甲醇（82∶18）；检测波长：210 nm；流速：1mL/min；柱温：30 ℃。

2.2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取苦杏仁苷对照品适量，加70%甲醇制成每1mL含苦杏仁苷 74.5 μg的溶液，即得。

2.2.4.3 供试品溶液的制备 精密吸取样品溶液1mL置25mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，摇均，微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4.4 阴性样品溶液的制备 称取除桃仁外的药材加10倍量水，煎煮2次，1.5 h/次，药液滤过，合并滤液，浓缩并定容至250mL，取1mL浓缩液，自供试品溶液的制备项下“取样品溶液1mL”起同法操作，制得阴性样品溶液。

2.2.4.5 标准曲线的绘制 精密量取苦杏仁苷对照品溶液（74.5 μg/mL）1，2，4，6，8，10，15 μL 进样，记录色谱图，测定其峰面积，并以峰面积（Y）对进样量（X）进行回归，得回归方程：Y=0.8549X+2.912 6，r=0.999 5。结果表明：在0.074 5～1.117 5 μg范围内，苦杏仁苷峰面积与进样量呈良好的线性关系。

2.2.4.6 阴性干扰的判断 吸取上述对照品、供试品及阴性对照溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，结果显示，阴性对照图谱与对照品、供试品图谱中苦杏仁苷相应的保留时间无其他峰干扰，表明选择性良好，阴性无干扰。结果见图2。

图2 高效液相色谱图

2.2.4.7 样品含量测定 精密吸取各供试品溶液各10μL进样，记录色谱图，根据供试品吸收度积分值与对照品积分值，外标两点法计算，即得。

2.2.5 单因素试验

2.2.5.1 提取时间的考察 按处方量取黄芩、栀子等药味共5份，各加水8倍量，煎煮1次，分别煎煮20、40、60、80、120min，滤过，浓缩定容至250 mL，测定苦杏仁苷含量和得膏率。结果见表8。

表8 提取时间考察结果表

表8结果表明，苦杏仁苷的提取率在提取60 min左右时可以达到最大，随着时间的延长，苦杏仁苷的提取率反而降低，这可能同苦杏仁苷对热不稳定，长时间加热导致其破坏有关；而干膏得率随着提取时间的延长呈增加态势。确定本工艺的提取时间为60min。

2.2.5.2 加水倍量的考察 按处方量取黄芩、栀子等药味共 5 份，分别加水 4、6、8、10、12 倍量，加热回流提取2次，60 min/次，滤过，合并滤液，药液浓缩定容至250mL，测定苦杏仁苷提取率和得膏率。结果见表9。

表9 加水量考察结果表

表9结果表明，8倍水量苦杏仁苷提取率达90%，干膏得率与10倍水量和12倍水量相比无明显差异，本着节能减耗的原则，确定本工艺加水量为8倍。

2.2.5.3 提取次数的考察 按处方量取黄芩、栀子等药味1份，每次加8倍量水提取1 h，提取3次，分别收集3次提取液，浓缩定容至250 mL，即得。测定苦杏仁苷提取率和得膏率。结果见表10。

表10 提取次数考察结果表 （n=3）

表10结果表明，随着提取次数的增加，苦杏仁苷的提取率和干膏得率都呈降低态势，提取2次和提取1次相比，苦杏仁苷的提取率和干膏得率都呈显著性降低，而提取3次和提取2次相比，降低并不明显，考虑到节约工时和效益最大化，确定以提取2次为宜。

2.2.6 验证试验 由上述试验确立最佳提取工艺为，药材水提取两次，每次加水8倍量，1.0 h/次。按上述确立工艺进行重复实验3次，结果见表11。验证试验结果表明，该工艺条件合理，可行，重现性好。

表11 提取工艺验证实验结果

3 讨论

科学合理地选择中药复方的提取工艺是保持原方疗效的关键和核心，也是中药剂型改进和创新的前提和基础。脑脉醒神胶囊是在其汤剂基础上改进而成的，处方复杂，各药味所含有效成分理化性质各异，有针对性地将提取工艺分为大黄醇提和其余药材水提，这样能够较好地提取有效成分并保留药物的药理活性成分［7]，更好地发挥药效。

在大黄醇提工艺中，首先通过单因素试验初步考察了乙醇浓度、提取时间、乙醇用量对大黄总蒽醌提取效率的影响，确定了提取时间为30min，选择出了正交试验的三因素三水平。然后用正交试验法考察了乙醇浓度、提取次数、乙醇用量三因素对大黄总蒽醌提取效率的影响，最终确定了最佳的大黄醇提工艺条件，验证实验结果表明优选的大黄醇提工艺稳定可行。

在水提工艺优选中，以苦杏仁苷和干浸膏得率作为考察指标，采用单因素试验考察了影响中药复方制剂水提的提取次数、提取时间、加水倍量几大主要因素，最终也较好地确定了其最佳的水提工艺条件，验证实验结果也表明优选的水提工艺稳定可行。此外，现代药理研究表明，苦杏仁苷具有多种生物学效应，如具有抗脑缺血与抑制血小板聚集作用，能明显提高脑缺血状态下细胞色素氧化酶的活力，改善能量代谢，延长细胞生存时问，促进组织细胞代谢及功能恢复和组织修复［8-9]，这与脑脉醒神胶囊有活血化瘀、开窍醒脑的主要作用相同，应为该制剂中主要有效成分之一，故选择苦杏仁苷作为工艺优选的考察指标是合理、可行的。