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澳洲坚果壳吸附3种阳离子染料的研究

2019-09-05杨新周郝志云田先娇马艳粉

热带作物学报 2019年7期
关键词:死皮微胶囊橡胶树

杨新周 郝志云 田先娇 马艳粉

摘  要  橡胶树死皮已成为制约天然橡胶生产发展的重要因子之一,研发轻简、高效的死皮防治技术是目前生产中亟需解决的问题。本文以海藻酸钠/壳聚糖为壁材,橡胶树死皮康复营养剂主要有效成分为芯材,通过复凝聚反应将橡胶树死皮康复营养剂制备成微胶囊。以微胶囊的包封率、载药量为制备工艺优化指标,通过L16(45)正交实验得出微胶囊的最佳制备工艺条件。研究结果表明,当壳聚糖浓度为2.0 mg/mL、营养剂用量为1 g,体系反应温度为40 ℃,pH为5,10%戊二醛用量为30 mL时,该工艺条件下制备的微胶囊相对圆整、粒度分布相对均匀(10~40 μm),其包封率达69.31%、载药量达14.35%。所得的最佳工艺制备条件为后期实现木质部埋植橡胶树死皮康复营养剂缓释微胶囊打下良好基础;为最终实现新型高效的橡胶树死皮康复技术应用提供依据。

关键词  橡胶树;死皮;康复;海藻酸钠/壳聚糖;微胶囊

中图分类号  S794.1      文献标識码  A

Abstract  Tapping Panel Dryness (TPD) is one of the important factors that restrict the development of natural rubber production. It is an urgent problem to develop simple and efficient prevention and treatment technology for TPD. In this paper, sodium alginate / chitosan was used as the wall material, and the main effective ingredients of TPD rehabilitation nutrition were used as the core material. The TPD rehabilitation nutrition was prepared into microcapsules by a complex coacervation reaction. An L16(45) orthogonal experimental design for the standardization of encapsulation rate and drug loading rate was applied to optimize the preparation procedure of the microspheres. The results showed that the best preparation condition were chitosan 2.0 mg/mL, nutritive agent 1 g, pH 5, 40 ℃, and glutaraldehyde 30 mL. The microcapsules prepared under this process were relatively round and uniform in size distribution, with encapsulation rate of 69.31% and drug loading rate of 14.35%. The optimum preparation conditions would lay a good foundation for the later implementation of slow-release microcapsules of TPD rehabilitation nutrients embedded in xylem, and provide theoretical references for the application of new and efficient rehabilitation technology for TPD in Hevea brasiliensis.

Keywords  Hevea brasiliensis; tapping panel dryness(TPD); sodium alginate / chitosan; microcapsule

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.019

橡胶树死皮是指乳管部分或全部丧失产胶能力的现象,其症状为割线排胶减少甚至完全停排。据估计,目前世界各植胶国约有20%~50%的橡胶树存在死皮现象,每年因此损失的天然橡胶产量为131~174万t,造成的直接经济损失约50亿美元[1]。我国是橡胶树死皮发病率较高的国家之一,尤其是在近些年,死皮发病率逐年大幅上升,全国死皮率高达24.71%[2],有的胶园死皮停割率达到60%以上,每年因此减少了大量的干胶产量。橡胶树死皮已成为制约天然橡胶生产发展的重要因子之一,如何对其进行有效的防治是目前生产急需解决的问题[3]。关于橡胶树死皮最早的防治方法是1912年Rutgers采用的刨皮法[4];1989年,Siswanto等[5]采用隔离、刮皮同时配合使用棕油(95%)+敌菌丹(5%)混和制剂对橡胶树死皮进行防治;20世纪七八十年代我国开始了刨皮、剥皮和开沟隔离等方法治疗橡胶树死皮的研究[6-7]。上述主要是物理防治方法,该类方法操作繁琐,容易对树体造成二次伤害,且恢复周期长。近些年,陈守才等[8]、冯永堂[9]、任建国[10]等先后发明了一些橡胶树死皮防治药剂,但在目前生产实践中未见上述药剂的应用。以上方法或药剂对橡胶树死皮防治能起到一定作用,但效果有限,因此需要进一步研发更高效的橡胶树死皮防治技术。中国热带农业科学院橡胶研究所橡胶树死皮防控技术团队自2009年起开展橡胶树死皮防控研究,经过多年的研究获得了一种橡胶树死皮康复营养液[11],通过对树干喷施该营养剂可以取得较好的死皮防治效果[12]。但该防治方法需要多次反复施药,劳动强度相对较大,且受天气及操作等外部因素影响。所以有必要对现有营养剂剂型及施用技术进行改进。树干木质部埋植法是在枝干上钻孔,将药物直接埋入木质部的一种施肥、给药方法。童风等[13]通过树干木质部埋植法矫正果树缺铁症取得良好的效果。黎仕聪等[6]通过树干打洞施药治疗橡胶树死皮。经施药后两年检查,约有70%病树病情减轻,15%病树恶化;而对照有75%病树恶化。可见采用打洞施药法治疗是有效的。但是,打洞部位木质部有一条干枯带长约30 cm,这表明药剂施入树干后,由于局部药剂浓度过大,导致伤树。海藻酸钠是具有负电荷的聚阴离子高分子化合物,在水溶液中含有—COO[14];壳聚糖在水溶液中含有—NH2,氨基的氮原子上有1对未共用的电子,能够从溶液中结合一个氢离子,形成带有—NH3+的聚电解质[15]。在一定条件下海藻酸钠分子与壳聚糖分子发生复合凝聚,在溶液中的溶解度降低,包覆在芯材周围凝聚形成微囊。本文以海藻酸钠及壳聚糖为壁材,橡胶树死皮康复营养剂有效成分[11]为芯材,将原水剂橡胶树死皮康复营养剂制备成微胶囊剂型。拟结合树干木质部埋植技术对橡胶树死皮进行防治,最终形成一套轻简、高效的新型橡胶树死皮康复技术。

1  材料与方法

1.1  材料

海藻酸钠(化学纯)由国药集团化学试剂公司提供;壳聚糖(脱乙酰度≥90%、黏度50~800 mPas)购自浙江金壳药业有限公司;冰醋酸、span-80、戊二醛、石油醚、异丙醇、氢氧化钠等均为国产分析纯,实验用水为去离子水。主要设备:欧洲之星搅拌器(德国IKA公司)、HH-W05L型数显恒温水浴锅(上海互佳仪器设备有限公司)、精度pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)、循环真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)、低速大容量离心机(上海飞鸽牌)、原子吸收分光光度计(日本岛津公司)等,其他为实验室常规玻璃仪器。

1.2  方法

微胶囊的制备:橡胶树死皮康复营养剂微胶囊的制备方法,包括如下步骤:配置一定浓度的海藻酸钠溶液,搅拌均匀,调整pH到要求值(A液);配置一定浓度的壳聚糖醋酸溶液,加入一定量的橡胶树死皮康复营养剂,充分溶解,调整pH到要求值(B液);将100 mL液体石蜡加入三口烧瓶,缓慢滴加2.5 mL的span-80,高速乳化10 min;向三口烧瓶中缓慢滴加A液100 mL,再继续搅拌10 min;缓慢滴加B液体50 mL,固化10 min;滴加一定量10%的戊二醛,反应2 h;离心、过滤、洗涤、干燥,得橡胶树死皮康复营养剂微胶囊。

微胶囊制备工艺的优化:通过查阅相关文献及预实验等分析,影响微胶囊成型的主要因素为壁材浓度(用量)、芯材(营养剂用量)、反应体系温度、pH及交联剂用量等。本研究以包封率、载药量为考察指标,设计L16(45)正交实验,结合前人经验及前期预实验,选定各因子及水平见表1。

微胶囊中营养剂有效成分含量的测定:将一定量微胶囊加入缓冲液中,在瓷研钵中充分研磨后微孔滤膜过滤,留滤液待用[16]。取适量滤液进行营养剂有效成分的测量。营养剂有效成分中各微量元素含量参照NY/T 1974-2010 《水溶肥料铜、铁、锰、锌、硼、钼含量的测定》[17]的仲裁法进行检测;中量元素含量参照NY/T 1117-2010 《水溶肥料 钙、镁、硫、氯含量的测定》[18]的仲裁法进行检測;大量元素含量参照NY/T 1977-2010《水溶肥料总氮、磷、钾含量的测定》[19]的方法进行检测。营养剂各有效成分含量的总和为微胶囊芯材的含量。

1.3  数据处理

按以下公式计算包封率及载药量[20]:

包封率=微囊中测得含有效成分量/微囊中加入的总有效成分量×100%;

载药量=微囊中含有效成分量/微囊总质量×100%;

综合评分:载药量的权重系数为0.4,包封率的权重系数0.6;

综合评分=载药量/MAX载药量×100×0.4+包封率/MAX包封率×100×0.6。

数据采用Excel软件和DPS 7.0软件进行统计分析。

2  结果与分析

2.1  各因素对各指标的影响分析

2.1.1  各因素对包封率的影响  有效成分包封率低,则溶液中游离有效成分的量大,损失大,达不到将药物制成制剂的目的,所以制备微胶囊时,要求药物的包封率尽可能高。如图1所示,壳聚糖浓度、反应温度及戊二醛用量对包封率的影响趋势相似,均呈先增大后减小的趋势;均存在一个峰值,壳聚糖浓度为2.0%,反应温度40 ℃,戊二醛用量为30 mL时,其对应包封率都最高。壁材(壳聚糖和海藻酸钠)浓度增加,体系黏度增加,可有效阻止微胶囊在制备过程中芯材(橡胶树死皮康复营养剂有效成分)从未固化的微滴扩散进入连续相,从而使包封率增加;但壳聚糖浓度过高,芯材移动受限严重,不利于其均匀分散,也会造成包封率降低。在一定范围内,当反应体系温度升高,壁材黏度减小,流动性增强,有利于两种高分子壁材的相互接触,形成微胶囊结构,将芯材包裹;但温度过高,壳聚糖-海藻酸钠反应激烈,凝聚物之间的自聚现象严重,不利于其对芯材的包裹。交联剂(戊二醛)用量过低,交联不完全,形成的微胶囊表面空隙较大,芯材包裹不严实,容易泄漏;用量过高,使制备的微胶囊壁材的弹性和韧性都下降,在高速搅拌过程中微胶囊容易破裂,最终导致包封率降低。

在实验设定的水平内,包封率随反应体系pH增大先略微降低,然后小幅上升,但整体波动不大。壳聚糖在低pH范围内—NH3+较多,而海藻酸盐链节中—COO-基团随pH的升高而增多,壳聚糖和海藻酸钠在pH相对较低或较高环境下更有利于其发生络合反应,形成微胶囊,从而提高包封率。图1显示,包封率随芯材(营养剂)用量增加层单调递交的趋势。在壁材用量不变的情况下,其包封能力是有限的,根据包封率的定义,随着芯材用量的增加,其包封率减小是很合理的。

2.1.2  各因素对载药率的影响  载药量是衡量一种微胶囊制备是否成功的重要指标,它的大小直接关系着该药剂的制备成本及其有效性。如图2所示,在设定的水平内,载药量随壳聚糖浓度及戊二醛用量增加先微弱增加,再呈单调递减趋势。壁材(壳聚糖及海藻酸钠)浓度较低时,其用量不能够完全包封加入体系中的芯材(营养剂有效成分),壳聚糖浓度的增加,宏观上体现为更多的芯材被包裹起来,因此载药量随着壳聚糖浓度增加而增加;当壳聚糖浓度继续增加,壁材与芯材比例达到一个适当的比例时,载药量达到一个峰值;而当壳聚糖用量继续增加时,形成的微胶囊膜可能增厚,因此载药量较小。同理,当交联剂(戊二醛)用量较小时,交联不完全,交联剂用量的增加,宏观上体现为更多的芯材被包裹起来,因此载药量随着交联剂用量增加而增加;随着其用量的增加,载药量相应增加,当达一个峰值后,随着交联剂用量的增加,微胶囊壁可能增厚,其载药量相应降低。

载药量随体系反应温度大体先增加,达到一个峰值后,再层递减趋势,其变化趋势和包封率随反应温度变化趋势相似。在较低温度范围内,温度的增加有利于壳聚糖与海藻酸钠的络合,形成微胶囊膜,将芯材包裹,从而提高其载药量;当载药量达一定峰值后,温度继续增加,壳聚糖-海藻酸钠反应激烈,凝聚物之间的自聚现象严重,减少其对芯材的包裹,同时由于局部反应激烈,在芯材表面形成的膜层也相对较厚,因此导致载药量降低。

载药量随pH增加而单调递减。虽然壳聚糖的分子扩散性能主要是由分子量决定的,但分子电荷密度的影响不能忽略。根据Lewis酸碱平衡理论,当壳聚糖溶液的pH

2.2  正交优化实验结果及分析

2.2.1  正交实验极差分析  正交实验的结果见表2,通过分析直观极差结果发现,5个因素对微胶囊包封率影响从大到小依次为:E>A>C>B>D,即:戊二醛用量>壳聚糖浓度>反应温度>营养剂用量>反应pH,最优组合为A3B1C3D4E2;4个因素对微胶囊载药量影响的主次因素关系为:B>A>E> C>D,最优组合为A2B4C3D1E2。综合考量包封率及载药量两指标对微胶囊制备成本及其自生有效性的权重。各因素对微胶囊的综合影响从大到小依次为:A>E>C>D>B,即:壳聚糖浓度>戊二醛用量>反应温度>反应pH>营养剂用量。

2.2.2  正交实验方差分析  通过方差分析中的F值可知,各因素对包封率的影响大小依次为:E>A>C>B>D,即:戊二醛用量>壳聚糖浓度>反应温度>营养剂用量>反应pH;各因素对载药量的影响大小依次为:B>A>E>C>D,营养剂用量>壳聚糖浓度>戊二醛用量>反应温度>反应pH;各因素对微胶囊综合指标的影响大小依次为:A> E>C>D>B,即:壳聚糖浓度>戊二醛用量>反应温

度>反应pH>营养剂用量(表3)。这一结果与极差分析的结果一致。

针对包封率,各因素的F值均小于临界值F0.05(3,3)=9.28,所以各因素对包封率的影响均不显著;针对载药量,因素A、B的F值大于临界值F0.05(3,3)=9.28,其他因素该值小于临界值,所以壳聚糖浓度及营养剂用量对载药量的影响显著,其他因素对其影响不显著;综合量指标,壳聚糖浓度、反应温度、戊二醛用量对微胶囊制备的综合指标影响显著,营养剂用量及pH对其影响则不显著。

综上,橡胶树死皮康复营养剂微胶囊复凝聚法的最佳制备工艺为:A3B1C3D4E2,即壳聚糖浓度为2.0 mg/mL、营养剂用量为1 g,体系反应温度为40 ℃,反应pH为5,10%戊二醛用量为30 mL。在此条件下制得的微胶囊相对圆整、粒度分布相对均匀(10~40 μm),其包封率达69.31%、载药量达14.35%。如图3所示,最优工艺条件下制备的橡胶树死皮康复营养剂微胶囊光学显微照片。

3  讨论

海藻酸钠/聚赖氨酸(APA)微胶囊是目前研究最多、最成熟的一种微胶囊, 但由于聚赖氨酸价格昂贵,生物相容性差,限制了APA微胶囊的应用。壳聚糖与聚赖氨酸结构相似,但壳聚糖在生物相容性和资源上有明显优势,逐渐成为聚赖氨酸的理想替代材料[22]。海藻酸钠/壳聚糖微囊作为药物的载药系统,具有缓释、控释等理想效果,应用前景较为广阔[23]。

本研究以海藻酸钠及壳聚糖为壁材,采用复凝聚法将橡胶树死皮康复营养剂制备成微胶囊,拟结合树干木质部埋植技术对橡胶树死皮进行防治。根據前期的探索性实验及文献,确定海藻酸钠与壳聚糖浓度比为1∶1[24],海藻酸钠与壳聚糖的质量比为1∶2时,其复凝聚反应最佳[25]。通过多指标综合评分结合正交实验方法确定其最优制备工艺为:壳聚糖浓度为2.0 mg/mL、营养剂用量为1 g,体系反应温度为40 ℃,反应pH为5,10%戊二醛用量为30 mL。在此条件下制得的微胶囊相对圆整、粒度分布均匀,其包封率达69.31%、载药量达14.35%。

王津等[16]以海藻酸钠和壳聚糖为基质材料制备布洛芬缓释微球,药物包封率为64.6%。孟庆廷等[26]用壳聚糖-海藻酸钠微囊技术制备一系列叶绿素亚铁微胶囊,包封率为30.4%~79.1%,载药量为13.9%~35.5%。金言[27]以壳聚糖和海藻酸钠为壁材,采用改良的复合法制备丁香酚微囊,微囊包封率为89.18%。南艳微等[28]以海藻酸钠和壳聚糖溶液为囊材,对牛血清白蛋白(BSA)进行反复包裹,得到载药量为16.47%~17.97%,包封率为55.00%~65.78%不等的微胶囊。余晓华等[29]以海藻酸钠/壳聚糖为载体包覆尿素,制备的微球尿素含量为10%~20%。贾利娜等[30]采用乳化交联法制备负载5-氟尿嘧啶的壳聚糖-海藻酸钠磁性载药微球,载药量为6.69%,包封率为22.00%。王召等[31]采用复凝聚法制备阿维菌素B2海藻酸钠-壳聚糖包埋颗粒剂,其载药量为22.38%,包封率为95.26%。由此可见,不同芯材由于其物化性能的差异,其包封效果会有所差异。本研究所制备的海藻酸钠/壳聚糖基橡胶树死皮康复营养剂微胶囊包封率、载药量分别为69.31%和14.35%,包封效果与前人研究相当。因此采用本方法制备橡胶树死皮康复微胶囊是比较可靠的。

通过极差分析及方差分析显示各因素对微胶囊综合指标的影响大小依次为:壳聚糖浓度>戊二醛用量>反应温度>反应pH>营养剂用量;其中壳聚糖浓度、反应温度、戊二醛用量影响显著。王岸娜等[32]研究显示壁材(壳聚糖/海藻酸钠)浓度对微胶囊的包埋率和载药量影响最大。因此,控制壁材浓度是微胶囊制备的关键。分析pH对包封率的影響表明,在一定范围内包封率随反应体系pH增大先略微降低,然后小幅上升。于炜婷等[33]的研究表明,当壳聚糖溶液的pH由3.5增加到6.5时,壳聚糖与海藻酸钠络合深度呈现高-低-高的趋势,与本结果相似。另外,整个反应体系pH不宜过低,也不宜过高;pH过低壳聚糖容易降解[16];对于海藻酸钠,pH过高也会发生降解[34]。于炜婷等[33]采用壳聚糖/海藻酸钠复凝聚法制备微囊化大肠杆菌时,反应溶液的最佳pH为5.0;王岸娜等[32]对壳聚糖-海藻酸钠复凝聚法制备微胶囊的研究表明最佳pH为5.5。可见pH在5左右,比较有利于海藻酸钠/壳聚糖体系发生复凝聚反应,形成微胶囊。

本研究将课题组前期开发的橡胶树死皮康复营养剂制备成微胶囊剂型,拟结合树干木质部埋植技术对橡胶树死皮进行防治。通过树干木质部埋植技术将药剂一次性埋入木质部,相对省工省时;因药物直接埋植在树干木质部,避免了树干周皮的阻隔及天气的干扰,药剂被树体直接吸收,药效快,且药剂利用率高;同时通过微胶囊技术实现药剂的缓慢释放,以期实现药剂释放与树体对药剂的需求同步,避免药剂直接施用局部药量过大伤树。本研究的开展为研发轻简、高效的橡胶树死皮康复综合技术提供技术支持,为研发新型的橡胶树死皮康复技术提供了新的思路。

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