芒果MinMYB10基因的克隆及表达分析载体的构建

白蓓蓓 荆永琳 蓝丽 王佳 赵志常

摘  要  MYB（myeloblastosis）转录因子主要参与调控植物类黄酮代谢、植物生长发育等。为了研究在芒果果实中类黄酮代谢调控机制，本研究从金煌果肉中克隆得到一个MYB基因，将其命名为MinMYB10，其全长cDNA序列为1021 bp，开放阅读框为837 bp。该基因编码的蛋白有278个氨基酸残基，分子重量为31.60 ku，等电点为5.89。通过系统发育分析发现MinMYB10与拟南芥是亲缘关系较近的蛋白。本研究还构建了基因沉默载体pTRV2-MinMYB10和过表达载体 pGreenII 62-SK-MinMYB10，以期在后续研究中探明MinMYB10基因在芒果果实花青素代谢中的作用。

关键词  芒果;MinMYB10基因;载体构建

中图分类号  S667.7      文献标识码  A

Abstract  The MYB （myeloblastosis） transcription factors are mainly involved in the regulation of flavonoid metabolism， growth and development in plants. In order to study how the flavonoid metabolic pathways are regulated in mango fruit， a MYB gene， designated as MinMYB10， was cloned from the flesh of Jinhuang mango fruit. The full-length cDNA sequence of MinMYB10 was 1021 bp long， containing an open reading frame of 837 bp which would encode a peptide of 278 amino acid residues with a molecular weight of 31.60 ku and an isoelectric point of 5.89. Phylogenetic analysis showed that the encoded protein sequence was closely related to its homolog from Arabidopsis thaliana. We have also constructed a silencing vector， pTRV2-MinMYB10， and an over expression vector， pGreenII 62-SK-MinMYB10， aiming to decipher the role of MinMYB10 in the metabolism of anthocyanin in mango fruit in our upcoming researches.

Keywords  mango; MinMYB10 gene; vector construction

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.008

转录因子（transcription factor，TF）又称反式作用因子，可以与真核基因的启动子区域中顺式作用元件发生特异性结合，是一类在生物体广泛存在的蛋白质分子[1]。转录因子一般由DNA结合区（DNA-binding domain）、寡聚化位点（oligomerization site）、转录调控区（transcription regulation domain）和核定位信号区（nuclear location signal）这4个功能区域组成[2]。MYB转录因子是高等植物中最大的转录因子家族之一，主要参与调控植物类黄酮代谢、植物生长发育、应答外界坏境和植物刺激等生理过程[3-7]。

芒果（Mangifera indica L.），属漆树科常绿大乔木，又名密望子、柁果、望果等。芒果树寿命可达几百年，原产印度及马来西亚[8]。其所含有黄酮类成分很高，在所有水果中少见，维生素C含量也不低，矿物质、蛋白质、脂肪、糖类等，也是其主要营养成分。目前，关于芒果MYB转录因子对果实类黄酮代谢反应调控机制研究报道较少[9]。本研究在前期研究的基礎上克隆得到一个MYB转录因子基因MYB10，命名为MinM YB10，同时对其编码的蛋白序列进行生物信息学分析，并进一步构建了沉默表达载体和过表达载体，为深入研究该转录因子的功能奠定基础，也为解析芒果果实花青素合成的调控机制奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

本研究所用试材均取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所的农业部儋州芒果种质圃，以金煌芒为试材。使用的试剂有TaKaRa PrimerSTAR Max DNA Polymerase、rTaq、克隆载体pEASY?-Blunt、大肠杆菌Trans-T1感受态、农杆菌GV3101等。

1.2  方法

1.2.1  芒果果肉总RNA的提取及cDNA的反转录  芒果果肉总RNA的提取参照天根公司生产的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒进行相关的操作，cDNA合成方法详见全式金公司TransScript?-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书。

1.2.2  MinMYB10基因的克隆  根据前期已经拼接得到的该基因的全长序列，设计上下游特异性引物扩增MinMYB10基因。PCR反应体系：1 μL cDNA模板，上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL，10 μL TaKaRa PrimerST AR MaxDNA聚合酶和8 μL ddH2O;PCR反应程序：98 ℃预变性5 s;98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 6 s，35个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存备用。连接pEASY- blunt载体，转化到Trans-T1大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性菌液送公司测序。

1.2.3  MinMYB10基因的生物信息学分析  利用NCBI上的ORF finder（https：//www.nc bi.nl m.nih.gov/orffinder/）查找MinMYB10基因的开放阅读框，并推测其氨基酸序列;运用ExPASy ProtParam软件（https：//web.expasy.org/protparam/）分析MinMYB10蛋白理化性质;使用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）软件分析氨基酸的疏水性与亲水性;使用DNAMAN和Prabi（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）软件分析蛋白质二级结构模型;使用SWI S S-MODEL（https：//swissmod el.expa sy.or g/I n t er acti ve/SW3VtZ/models/）在线软件预测并构建MinM YB10蛋白的三级结构模型;利用NCBI上的Blastp（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索Min M YB10蛋白的同源序列;使用NCBI中的Conserved domains（https：//www.ncbi.nl m.nih.g ov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi？RID=NG6HM4 ME014 & m ode=all）分析MinMYB10蛋白序列的保守结构域;利用MEGA 7.0软件进行同源序列比对并构建系统进化树。

1.2.4  载体构建  （1）pTRV2-MinMYB10基因沉默载体的构建。首先使用限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ对载体pTRV2和目的基因MinMYB10进行双酶切。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，分别将目的基因和酶切后的载体条带进行切胶回收。然后用T4连接酶（全式金公司）22 ℃连接20 min，连接体系为：pTRV2载体片段1 μL，MinMYB10目的基因片段4 μL，T4连接酶0.2 μL，10T4 Buffer 1 μL，ddH2O 3.8 μL。转化到Trans-T1大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性菌液扩繁提质粒进行双酶切检测，最后转化GV3101农杆菌感受态，筛选阳性菌液，将菌液与50%的甘油按照体积1∶1混合，于?80 ℃保存。

（2）pGreenII 62-SK-MinMYB10基因过量表达载体的构建。首先使用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对载体pGreenII 62-SK和目的基因MinMYB10进行双酶切。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，分别将目的基因和酶切后的载体条带进行切胶回收。然后用T4连接酶（全式金公司）22 ℃连接20 min，连接体系为：pGreenII 62-SK载体片段1 μL，MinMYB10目的基因片段4 μL，T4 连接酶0.2 μL，10T4 Buffer 1 μL，ddH2O 3.8 μL。转化到Trans-T1大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性菌液扩繁提质粒进行双酶切检测，最后转化GV3101农杆菌感受态，筛选阳性菌液，将菌液与50%的甘油按照体积1∶1混合，于?80 ℃保存。

2  结果与分析

2.1  金煌芒果果肉总RNA的提取

提取金煌芒果果肉总RNA，用核酸蛋白仪测定其浓度800～1000 ng/μL，纯度OD260/OD280的比值为1.8～2.0，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，有2条清晰完整的条带（图1）。

2.2  MinMYB10基因全长的克隆

以金煌芒完熟期果肉cDNA为模板，以ORF两侧设计引物进行PCR得到MinMYB10基因的cDNA全长。在1.0%琼脂糖凝胶电泳图上，目的片段约1000 bp（图2），与预期结果一致。测序后，利用ORF finder分析得到基因CDS区为837 bp，编码278个氨基酸，蛋白质分子质量为31.60 ku，等电点为5.89。

2.3  MinMYB10基因序列、同源性、结构域及进化树分析

根据MYB10基因编码蛋白序列，在NCBI上利用Blast P搜索并下载该蛋白的同源序列。选择与MinMYB10同源性较高的物种进行同源比对，物种分别为芒果（Mangifera indica L.）、可可（Theo broma cacao）、榴莲（Durio zibethinus）、亚锦葵（Herrania umbratica）和葡萄（Vitis vinifera），可了解它们之间的亲缘关系（图3）。使用NCBI上的Conserved domains分析MinMYB10蛋白結构域，结果显示MinMYB10含有PLN0 3 212、

MinMYB10： MYB10 of Mangifera indica L.; TcaMYB10： MYB10 of Theobroma cacao; HumMYB10： MYB10 of Herrania umbratica; DziMYB10： MYB10 of Durio zibethinus; VviMYB10： MYB10 of Vitis vinifera.

2.4  MinMYB10基因载体的构建

2.4.1  pTRV2-MinMYB10基因沉默载体的构建  首先使用Takara PrimerSTAR MaxDNA聚合酶扩增基因全长，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测回收目的条带，将pTRV2空载体和目的基因MinMYB10用BamHⅠ和XbaⅠ进行双酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测回收目的条带，然后利用T4连接酶连接回收条带，构建沉默载体pTRV2-MinMYB10，转化到Trans-T1大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性菌液进行扩繁，之后提取pTRV2-MinMYB10重组质粒，再用BamHⅠ和XbaⅠ进行双酶切验证，酶切目的基因片段为1000 bp（图9A），与预期结果相吻合，表明pTRV2-MinMYB10重组质粒表达载体构建成功。pTRV2-MinMYB10转化到GV3101农杆菌，菌液PCR检测到目的基因已成功转化到农杆菌菌株（图9B）。

2.4.2  pGreenII 62-SK-MinMYB10基因过量表达载体的构建  首先使用Takara PrimerSTAR MaxDNA聚合酶扩增基因全长，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测回收目的条带，将pGreenII 62-SK空载体和目的基因MinMYB10用BamHⅠ和XhoⅠ进

3  讨论

MYB转录因子N端含有MYB保守结构域，该区域由50多个氨基酸组成。MYB转录因子含有1～3個不完全重复的串联结构域（R1、R2和R3）[10]。依据MYB结构域的数目不同，MYB转录因子分为4个亚类：1R-MYB、2R-MYB（R2R3-MYB）、3R-MYB（R1R2R3-MYB）和4R-MYB（four R1/R2）[11]。MYB转录因子虽然在序列上具有一定的保守性，但在不同物种、不同个体或同一个体的不同组织器官中发挥着不同的功能。如：拟南芥中AtMYB21和AtMYB24通过调控植物激素茉莉酸的合成来影响花青素的积累[12]。研究发现杨树的PtrMYB3和PtrMYB20[13]，小麦的TaMYB4[14]、水稻的OsMYB46和玉米的ZmMYB31等[15]均参与细胞壁形成。植物中MYB类转录因子主要以R2R3-MYB的形式存在，主要参与植物初生和次生代谢以及对外界刺激和胁迫的应答过程。在模式植物拟南芥中已鉴定出130多个R2R3-MYB基因。在Stracke等[16]的研究中，拟南芥的133个R2R3-MYB基因被划分为24个亚类，其中第10亚类MYB10主要调控花青苷的合成代谢过程。近年来已有研究报道MYB转录因子在苹果（Malus domestica）[17]、樱桃（Prunus avium L.）[18]、草莓（Fragaria ananassa）[19]和葡萄（Vitis vinifera）[20]等果实的花青素合成中起关键调控作用。本研究从金煌芒芒果果肉中克隆得到MinMYB10基因，分析其结构域发现存在两个MYB结构域，属于R2R3-MYB转录因子，并且与其他物种R2R3-MYB家族成员在此区域高度保守，开放阅读框为837 bp，编码278个氨基酸，蛋白质分子质量为31.60 ku，等电点为5.89，不稳定指数为56.17，为不稳定蛋白。

花青素（Anthocyanins）是一种天然的植物色素，对于植物组织器官呈色具有重要的影响。近年来对花青素的研究也有了一定进展。Vimolma ngkang等[21]研究报道过量表达苹果R2R3-MYB转录因子MdMYB3可以促进烟草合成花青素和黄酮醇，使转基因烟草的花色加深。在月季中，R2R3-MYB转录因子RhMYBs4-1和RhMYBs6-1也均可促进花青苷的合成[22]。本研究克隆的MinMYB10具有典型的R2R3结构域，可推测其参与芒果果实花青素的合成过程，对芒果果实花青素合成相关基因进行克隆与表达分析，有助于阐明花青素合成与代谢对芒果果实呈色的调控机理，并进一步构建了沉默表达载体和过表达载体，为更深入解析该基因的功能奠定理论基础。

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