基于钌(Ⅱ)多吡啶配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+的单链DNA分子光开关性能

宋伟 涂小宝 祁慧晨 徐加发 田丹碧

摘要：在合成DNA的熒光探针[Ru（bpy）2dppz]2+（RuBD）的过程中，初步发现了其特别的分子光开关特性，不仅取决于双链DNA（dsDNA）还取决于单链DNA（ssDNA）。当RuBD与水溶液中的DNA酶结合时，荧光强度在dsDNA / RuBD和ssDNA / RuBD之间显示出明显的差异。此外在实验中，发现ssDNA / RuBD比dsDNA / RUDB的荧光更强，故我们采用荧光光谱，荧光显微镜和电化学法等方法，进一步研究RuBD与ssDNA的性质。

关键词：钌（Ⅱ）多吡啶配合物;分子光开关;单链DNA（ssDNA）;双链DNA（dsDNA）

虽然钌（Ⅱ）多吡啶配合物 [Ru（bpy）2（dppz）]2+作为核酸的光谱探针已有二十多年的历史，其独特的性质在生物化学、细胞生物学、诊断和治疗方面的应用前景直到最近才受到重视[1-5]。作为体外和离体的理想探针，它已被用于实时跟踪技术，该技术使用荧光显微镜监测活细胞中的单个病毒组分或DNA序列，因为它们具有强烈的双链DNA（dsDNA）结合亲和力，低背景辐射、长寿命光开关效应和红移发射[6-9]。

RuBD的光开关效应普遍认为归因于dsDNA碱基之间高度平面dppz配体的插入[1，10-13]，使得条带研究和应用仅涉及dsDNA。单链DNA （ssDNA）的光开关效应似乎被忽略，对它的研究很少。

在设计以RuBD为荧光探针的Pb2+荧光传感器过程中，我们首先发现RuBD的光开关效应不仅依赖于与dsDNA的结合，还依赖于与ssDNA的结合。我们进一步采用荧光光谱法、荧光显微镜等，研究ssDNA对RuBD的性质。我们希望我们的发现有助于更清楚地呈现RuBD DNA的结合机制，对其未来的生物应用提供新思维，RuBD在新型诊断剂方面具有重要应用价值，此类诊断剂不仅适用于双链DNA /单链DNA，以及用于核酸位点和结构的通用治疗[14-18]和生物化学探针设计[19-21]。

[Ru（bpy）2（dppz）]（BF4）2 的合成遵循文献[22，23]，采用荧光光谱法研究RuBD的结合性能。结果表明，与双链DNA结合的RuBD荧光明显增强，说明RuBD的结合作用（图1）。

我们在脱氧核酶（DNAzyme）裂解反应中发现了RuBD的特殊性质，它可以在ssDNA存在时产生显着的荧光效应，这一特性这已被应用于制备Pb2+ 生物传感器 [24]。

8-17 ssDNA，是一种对Pb2+有特异性催化作用的单链DNA分子。这种DNA分子生产成本低，可多次变性和复性且不丧失活性或结合能力，特别是其催化链可以借助Pb2+，催化底物链的裂解[25，26]。

在我们最初的设计策略中，仅仅基于RuBD与dsDNA的结合能力，故选用RuBD作为荧光探针。但在试验过程中，结果超出了我们的预期。

荧光光谱可以发下RuBD在5mM Tris缓冲溶液中具有可忽略的荧光（图2，粉红色三角形点）。当RuBD与8-17 dsDNA溶液混合时，荧光强烈发射（红色圆点），证明了RuBD典型的光开关特性。通过添加Pb2+，8-17 dsDNA核酶水解成8-17 ssDNA和一些底物片段。如果RuBD的光开关效应仅取决于dsDNA的插入，那么含有8-17 ssDNA和信号链底物片段的混合液的荧光强度将降低或检测不到。但令人惊讶的是，该混合溶液的荧光强度显著增强（～75%）（黑色四角点）。

用一种特殊设计的GR-5 DNA核酶进行DNA的裂解反应，其性能与8-17 DNA核酶相似。发现该溶液的荧光强度也增大，说明RuBD与双链DNA可以产生较强荧光，也可以与单链DNA产生较强荧光。为了验证RuBD的分子荧光开关性能，我们分别使用DNA dsDNA和ssDNA溶液（8-17 dsDNA和8-17ssDNA，GR-5 dsDNA和GR-5 ssDNA）测试荧光强度。 通过向溶液中添加等量的RuBD，产生的荧光强度如图3，由此我们发现，ssDNA / RuBD的荧光强度增强尤其显著，约增强250%（GR-5 ssDNA/RuBD，绿色三角形点）和300%（8-17ssDNA/ RuBD，蓝色四角点）。

为了进一步确认RuBD的荧光特性，我们设计了两个长度相同但结构不同的DNA，其中一个（DNA/H）呈发夹状，另一个（DNA/S）呈直线状。图4显示，在相同条件下，RuBD与DNA/S结合产生的荧光强度强于DNA/H，且与荧光显微镜图像结果一致。 与DNA/H相比，RuBD与单链DNA/S结合产生更强更显著的荧光特性。

RuBD可能通过静电作用与ssDNA结合，尽管联吡啶配体部分插入的可能性不能完全消除[28-31]。我们采用循环伏安法（CV）进一步考察。通过巯基-金的相互作用，将5'末端具有硫醇的ssDNA固定在工作电极金电极表面。将ssDNA修饰的电极在封闭试剂MCH溶液中进一步孵育，以获得良好排列的DNA单层，防止RuBD进入电极表面。分别在缓冲液（a）和RuBD溶液（b）中对修饰电极进行循环扫描，在RuBD溶液中电流峰值明显增强（见图5）。采用计时库仑法进行实验，也具有一致的结果。由于RuBD的静电吸附，峰值电流可归因于表面受限的氧化还原过程，证明了我们先前假设的吸附作用（图6）。

综上所述，钌（Ⅱ）多吡啶配合物（RuBD）不仅可以插入dsDNA，还可以插入ssDNA，值得引起我们关注的是，其和ssDNA作用时产生的荧光强度远远大于dsDNA。我们希望关于RuBD的分子光开关特性能引起科学界的关注，其在化学传感、生物传感、生物示踪、荧光成像、超分辨成像等领域表现出极大的潜在应用价值，值得进一步研究开发。

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