青稞AFLP体系的建立及优化

王姗姗　刘小娇　靳玉龙　白婷　朱明霞　王波　张文会　张玉红

摘要本文以青稞为材料，对AFLP酶切连接、预扩增、选择性扩增过程进行优化。结果表明，酶切反应条件为DNA模板200ng、限制性内切酶EcoRI/MseI4U、酶切时间4h;连接反应条件为连接温度16°C，T4连接酶3U，连接时间12h以上;预扩增反应条件为rTaq聚合酶3U、dNTP4mmol/L、镁离子浓度1.00mmol/L;选择性扩增反应条件为rTaq聚合酶4U、dNTP4mmol/L、镁离子浓度1.25mmol/L及预扩产物稀释10倍。利用优化后的AFLP体系，以藏青2000、冬青18这2个供试材料的基因组为模板，从100对引物组合中筛选出10对重复性好、稳定性强、扩增条带清晰、分布均匀、多态性高的引物组合，为青稞种质资源鉴定及遗传多样性分析提供了基础。

关键词 青稞;AFLP;PCR体系优化;引物筛选

中图分类号 S512.3

文献标识码 A

文章编号 1007-5739（2019）05-0003-04

青稞（Hordeum vulgare）是西藏自治区的主要粮食作物，2017年产量达78万t。随着开发应用的逐步深人，青稞在酿造产业、保健食品及再生能源方面显示出极大的开发潜力和应用前景。青藏高原地形地貌复杂，气候带齐全，土壤种类繁多，区域小气候明显，生长环境迥异，使西藏地区青稞具有更为丰富的多样性"。孙立军等在9000份中國大麦栽培种中以穗部形态特征鉴定出420个变种，而中国特有300个变种，其中西藏高原的变种类型最丰富，高达60%。西藏地区青稞的多样性是开发优良作物的遗传基础，然而随着现代育种目标朝着高产、品质优良和抗逆性强的方向迈进，遗传基础单一，基因流失的现象日益严重。因此，需要广泛收集多样的农家品种、地方品种及野生种，同时对现有的种质资源进行深入分析。

AFLP（amplified fragment length polymorphism）技术是由Vos于1995年发明的一种新型分子标记技术，由RFLP技术结合PCR技术而成回。AFLP的优点主要表现为：一是DNA模板需要量少;二是不需事先了解待研究物种的基因组信息;三是稳定性强;四是重复性好;五是覆盖整个基因组;六是非等位基因出现共迁移的概率很低;七是条带多;八是多态性高4。

AFLP被公认为是一种非常有效的理想的分子标记技术，已广泛应用于种群结构分析检测遗传多样性、系统发育等方面的研究[5-8。AFLP由于可以分辨出基因组的细微差异，因而可以在“DNA指纹水平”进行个体鉴定、亲缘关系及遗传多样性的分析9。用AFLP的3个引物就可鉴别出一个山龙眼种群96%的种子的父本10。AFLP在多个物种中用于AFLP指纹图谱构建及物种资源的遗传多样性分析，如梨、花生等。

本文根据AFLP分子标记技术稳定性强、重复性好及多态性高的特点，对AFLP酶切连接预扩增选择性扩增过程进行优化，同时从100对选择性扩增引物中筛选重复性好、稳定性强、扩增条带清晰分布均匀、多态性高、可用于青稞种质资源鉴定及遗传多样性分析的引物组合，以期为青稞遗传改良和亲本选配提供一定的理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1植物材料。试验所选青稞品种为西藏自治区主推青稞品种，分别为春青稞藏青2000和冬青稞冬青。

1.1.2接头和引物信息。试验用接头、预扩增及选择性扩增引物（表1），均由生工生物工程有限公司合成。其中，选择性扩增引物共10对，可形成100对引物组合。

1.2试验方法

1.2.1青稞基因组DNA提取。在三叶期剪取青稞幼苗，采用改良版CTAB法提取DNA，用1.0%琼脂糖电泳检测DNA质量并估测DNA浓度。DNA样品在-20C下保存备用。

1.2.2AFLP限制性酶切和连接。选取的限制性内切酶组合为EcoRI/MseI，将提取纯度较高的植物基因组进行限制性酶切和连接。对模板浓度EcoRI/MseI限制性酶浓度、T4连接酶浓度及酶切时间和连接时间进行优化。

连接反应的试验设计为T4连接酶2U连接时间6h、T4连接酶2U连接时间12h、T4连接酶3U连接时间6h、T4连接酶3U连接时间12h;酶切反应的试验设计见表2。

1.2.3AFLP预扩增。以酶切连接产物为模板，进行预扩增，并对rTaq聚合酶浓度、镁离子浓度和dNTP浓度进行优化，试验设计方案见表3。

PCR扩增程序：949C预变性3min;94C变性45s;50C复性45s，729C延伸1min，26个循环。

1.2.4AFLP选择性扩增。用1XTE稀释预扩增产物作为PCR反应模板，选用Touch-downPCR进行选择性扩增，并对预扩产物稀释倍数、rTaq聚合酶浓度镁离子浓度和dNTP浓度进行优化，试验设计方案见表4。

PCR扩增程序：95C预变性5min;95C变性35s，65C复性35s（每循环降低0.7C），72C延伸1min，12个循环;94C变性30s，56C复性30s，72C延伸1min，23个循环。

1.2.5变性电泳。选择扩增PCR产物，94C变性10min后进行6%变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分析，银染后观察，检测引物扩增效果。

2结果与分析

2.1青稞基因组DNA提取与检测

DNA质量直接影响到AFLP的酶切连接过程，将提取的基因组DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳后显像，条带压缩紧密，没有拖尾现象，并且条带与入DNA条带一致（图1）。表明DNA质量能够满足AFLP的试验要求，也说明采用的DNA，提取方法适合青稞基因组DNA的提取。

2.2青稞AFLP酶切反应条件筛选