发光细菌法在农药污染毒性检测中的应用研究进展

韦淑稳　董莉莎　张岩　裴义山　徐升

摘要发光细菌法具有反应快速灵敏、低价高效、对环境友好等特点，常用于环境污染监测。本文综述了发光细菌法在农药污染毒性检测领域的应用研究进展，重点介绍了费氏弧菌、青海弧菌、明亮发光杆菌在人工合成化学农药、生物农药单一毒性检测以及在重金属一农药联合污染毒性检测中的应用，并提出了发光细菌法在农药与其他多重污染物毒性检测中的应用前景。

关键词 发光细菌法;农药污染;毒性检测

中图分类号 TQ450.9

文献标识码 A

文章编号 1007-5739（2019）05-0121-04

1国内外农药污染现状

目前，世界上生产和使用的农药有几千种，生产上每年要使用约350万t的农药，并以10%左右的速度递增。其中，中国、美国、阿根廷占到了70%;仅中国就约占总量的50%，成为世界第一生产和出口大国。我国农药生产主要集中在江苏浙江、天津、山东等省（市），其中江苏、浙江的农药产量占全国总产量的1/3以上，农药使用量较大的是山东、江苏、广东、浙江等省。农药施用后，仅有30%左右附着于植物体上，或渗入植株体内残留下来，使粮、菜、水果等受到污染;其余70%左右散落在土壤上，或蒸发、散逸到空气中，或随雨水及农田排水流入河湖，污染水体和水生生物，经食物链最终进入人体，引起各种慢性或急性病害，严重危害人体健康。2015年以来，农业部开展化肥、农药使用量零增长行动，每年安排逾40亿元专项资金，坚持“产出来”“管出来"两手抓、两手硬，切实提高农产品质量安全水平，强化投人品管理，提升绿色生产水平。在加强农药、兽药等投入品生产销售管理的同时，进一步强化安全用药指导服务，有效控制残留超标，消除风险隐患。

2发光细菌的分类及其毒性检测原理

2.1发光细菌的分类

发光细菌是一种非致病性、能进行生物发光的细菌，多数为海生，与发光浮游生物相同，能引起海面发光。发光细菌有传统分类、系统分类、数值分类等几种不同的分类方法。目前，多以美国学者P.Baumann的分类方法进行划分，分为弧菌属、发光杆菌属和发光异短杆菌属"。

2.2发光细菌法毒性检测原理

正常条件下，发光细菌能发出肉眼可见荧光，响应波长为450-490nm。发光菌形态多种多样，但生理特性却非常相似，发光机理基本相同。发光细菌含有荧光素荧光酶ATP等发光要素，在有氧条件下由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸（FMNH2）、长链脂肪醛氧化为FMN、长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为450～490nm处的可见蓝绿光。

当细胞活性升高、处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强;而毒性物质的存在会直接抑制参与发光反应的酶类活性，并抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程，抑制发光，且毒性越強抑制效果越明显。在一定的试验条件下，发光细菌发光强度恒定，发光变化的程度与受试物的浓度在一定范围内呈相关关系，同时与该物质的毒性大小有关。大量的研究表明，用发光细菌检测毒性的结果与鱼类或小鼠毒性检测的结果相比，其一致性较好，对污染物或毒性物质的检测试验仅需15～60min，具有快速灵敏、低价高效、对环境友好等特点。对于能够干扰或破坏发光细菌呼吸、生长、新陈代谢等生理过程的任何有毒物质都可以根据发光强度的变化来测定，如重金属、CN-、农药、酚类化合物、抗生素等。目前，国内常用的3种发光细菌为明亮发光杆菌费氏弧菌、青海弧菌。其中，应用于农药污染毒性检测中的主要发光细菌种类见表1。

3发光细菌法在农药污染毒性检测中的应用

3.1在人工合成化学农药污染毒性检测中的应用

3.1.1杀虫剂。目前，中国杀虫剂市场正面临市场占比和使用量双降的态势，产品安全性环境友好性逐步提高，但杀虫剂的用量及其对环境的影响依然是农药中最大的种类。张欢等采用青海弧菌冻干粉对不同浓度农药敌敌畏溶液的毒性进行快速测试，试验结果表明，系统的稳定性、可重复性、准确性可达到甚至优于传统方法。袁东星等4通过激活冻干发光细菌粉对空心菜中6种有机磷农药乳剂（甲胺磷敌敌畏、辛硫磷、氧乐果、甲基异硫磷、水胺硫磷）进行检测，响应结果表明，发光强度与6种农药毒性均成负相关关系，检出限约为1mg/L，测定下限为3mg/L，响应曲线满足现场快速检测的要求。吴淑杭等以明亮发光杆菌T3变种作为毒性测试物种，研究了乐果、杀虫单等8种化学杀虫剂急性毒性，结果表明，在一定浓度范围内，不同杀虫剂对明亮发光杆菌的急性毒性不同，发光菌的相对发光率与杀虫剂浓度成极好的线性负相关;4种有机磷杀虫剂乙酰甲胺磷、乐果敌敌畏与敌百虫对明亮发光杆菌的ECo（15min）分别40.33、38.42、31.11、11.10mg/L，2种拟除虫菊酯类杀虫剂氰戊菊酯、高效氯氰菊酯ECso分别为23.56、14.63mg/L，哒螨灵和杀虫单ECo分别为18.32、2.72mg/L，相较而言，有机磷杀虫剂对发光菌的毒性更弱一些。修垒等6选取氯氰菊酯、敌敌畏2种农药作为污染检测物，利用青海弧菌Q67测定其对发光细菌的毒性影响，得出毒性大小为氯氰菊酯>敌敌畏，虽然测试菌种不同，但是2种农药对发光细菌的毒性大小与吴淑杭等研究结果相似。

在测试条件的研究方面，唐雪惠等叫以敌敌畏和氧化乐果为研究对象，采用以发光菌综合毒性检测技术为基础的在线毒性分析仪监测有机磷类农药对水体的水质毒性效果，结果表明，氧化乐果和敌敌畏均能引起明显的毒性反应，ECxo与ECso均为mg级，该在线毒性监测仪更适用于突发性高浓度特征污染物的水质预警。魏芳等8以明亮发光杆菌为菌种，以40%乐果乳剂为供试农药，不仅初步研究了农药毒性可检测的浓度范围及灵敏度，同时初步确定pH值为7条件下发光强度最强。

在土壤中农药的检测研究中，张建江等以明亮发光杆菌作为测试菌种，对土壤中敌百虫进行毒性测试得出发光菌的相对发光率与敌百虫的浓度成负相关。张胜田等1以典型有机氯农药氯丹为研究对象，重点研究了氯丹在不同理化性质土壤颗粒中的吸附特性及其对发光菌急性毒性的影响，研究结果表明，不同粒径的土壤颗粒对氯丹的吸附性能依次为黏粒（<2μm）≈粉粒（2～20μum）>粗砂（200～2000pum）>细砂（20～200μm），4种土壤颗粒浸出液对发光菌毒性与吸附能力成负相关，较大粒径（20～2000μm）土壤颗粒吸附氯丹后易于解吸，对发光菌的急性毒性最大。Jose Antonio等叫研究了2种废弃矿井土壤的农药流动性和渗滤液毒性，发现农药渗滤液对生物发光抑制的一般趋势不像金属浓度随时间降低，而且污染土壤经改良能轻微减轻对费氏弧菌的毒性，结果与农药淋出量减少趋势一致。农药污染土壞渗滤液的毒性评估可以为化学分析提供有价值的补充信息，但目前我国尚缺乏以发光细菌为试验对象对土壤中的有毒污染物进行测试的标准试验方法。