全自动凝胶净化-气相色谱质谱联用法测定水果中邻苯基苯酚和增效醚的残留量

李世艳　鲁佳　郭庆

摘要建立了全自动凝胶净化-气相色谱质谱联用法同时测定水果中邻苯基苯酚、增效醚残留量的方法，即脐橙、梨、菠萝等3种水果样品经粉碎后，加入丙酮+二甲苯（体积比2：1）超声波提取16min，经全自动凝胶色谱系统（GPC）净化、浓缩、定容后，用气相色谱质谱联用仪测定邻苯基苯酚、增效醚残留量，并以环氧七氯为内标物进行定量。结果表明，该方法的相关系数均达到0.999以上，定量下限均小于0.02mg/kg;添加25、50、100μg/kg3个水平的邻苯基苯酚和增效醚于脐橙、梨、菠萝空白样品中，加标回收率范围为80.2%～107.8%，相对标准偏差范围为0.9%～2.9%。该测定方法操作简便、快速、准确、灵敏、重现性好，适用于水果中邻苯基苯酚和增效醚残留量的快速分析测定。

关键词 水果;邻苯基苯酚;增效醚;全自动凝胶色谱系统（GPC）;气相色谱质谱联用仪

中图分类号 S481*.8

文献标识码 A

文章编号 1007-5739（2019）05-0103-03

邻苯基苯酚（o-phenylphenol）又名2-羟基联苯或2-苯基苯酚，为白色薄片或块状物或淡红色粉末，微溶于水。邻苯基苯酚是用途十分广泛的有机化工产品，广泛应用于杀菌防腐领域！”。在农产品贮藏与加工方面，邻苯基苯酚主要作为高效广谱的杀菌防霉剂广泛应用于采收后的水果和蔬菜的防腐保鲜2-31，特别适用于柑橘类水果的防霉;而增效醚（piperonyl butoxide）可作为该类杀菌防霉剂的增效剂，是联合国粮农组织唯一认可的高效无毒广谱农药增效剂4。但是，过量使用该类杀菌防霉剂对人体有致癌性、致畸性，并可造成肝脏和肾脏严重受损，而在水果贮存、运输过程中，常有过量加入杀菌剂的情况。因此，建立一种准确、快速的检验方法意义重大。

本试验采用全自动凝胶色谱系统（GPC）进行样品前处理，净化过程采用全自动批量处理，较大程度地减少了人为因素的影响，在提高检测效率、降低检测成本的同时，满足邻苯基苯酚、增效醚等杀菌防霉剂在果蔬中残留量准确快速批量检测的需求。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料。脐橙、梨、菠萝（市售）。

1.1.2试剂。乙腈（色谱纯）、丙酮（色谱纯）、二甲苯（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、乙酸乙酯（色谱纯）、环己烷（色谱纯）、邻苯基苯酚标准品（99.8%，Dr.Ehrenstorfer Gmb H）、增效醚标准品（96.0%，Dr.Ehrenstorfer Gmb H）、环氧七氯标准品（99.0%，Dr.Ehrenstorfer Gmb H）。

1.2仪器与设备

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪[DB-1HS色谱柱（30mx0.25mm，0.25μm）]，美国安捷伦公司;XHF-D高速分散器（内切式匀浆机），宁波新艺超声设备有限公司;优普超纯水设备，美国Millipore公司;MTN-2800W氮吹仪，天津奥特赛恩斯仪器有限公司;RV10旋转蒸发仪，安徽盈海贸易有限公司;Vortex3000涡旋器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司;ME204E/02电子分析天平，梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司;全自动凝胶色谱系统（GPC）。

1.3测定方法

1.3.1样品前处理。将所购水果样品切碎混匀，制成匀浆，备用。

1.3.2提取。称取20g试样，置于200mL烧杯中，加入定量内标环氧七氯后，以40mL乙腈为提取溶液，7000r/min匀浆提取2min，加人2g氯化钠，振摇10min，静置分层后，将有机相全部转移至100mL具塞锥形瓶中，残渣以20mL乙腈重复提取1次，提取液合并，经无水硫酸钠干燥后，旋蒸浓缩至1mL左右。加入2mL乙酸乙酯-环已烷（体积比为1：1），再浓缩至1mL左右，反复3次。将最终浓缩液转移至GPC系统配套进样试管中，用乙酸乙酯环已烷（体积比为1：1）溶液洗涤蒸馏瓶数次，合并洗涤溶液至试管中，定容至5mL。

1.3.3净化。全自动凝胶渗透色谱系统净化：试样由5mL试样杯注入凝胶渗透色谱柱，泵流速5.0mL/min，以乙酸乙酯-环已烷（体积比1：1）溶液洗脱，弃去0～8min流分，收集8～16min流分，16～20min冲洗GPC柱。将收集的流分旋转蒸发浓缩至约1mL，氮吹至干，以正已烷定容至1mL，待上机测试。

1.3.4色谱条件。DB-1HS色谱柱（30mx0.25mm，0.25μm）石英毛细管柱;进样口温度290C;质谱检测器（MSD）;载气为高纯氦气（纯度>99.999%），流速为1mL/min;不分流进样，1.5min后打开分流阀和隔垫吹扫阀，进样量1μL。升温程序：初始温度60C，保持0.5min;以209C/min升温至300C，保持6min。

离子化方式为电子轰击（EI）;离子化能量为70eV;离子源温度230C;传输线温度为GC-MS接口温度280C;溶剂延迟3min;全扫描范围为45～550amu。选择离子检测：邻苯基苯酚（170），增效醚（176），环氧七氯（353）。

1.3.5工作標准曲线的绘制及检出限的确定。分别准确称取1mg邻苯基苯酚、增效醚和环氧七氯标准品于10mL容量瓶中，以乙腈稀释定容，则为100μg/mL标准储备液，然后置于4C保存。临用前准确移取邻苯基苯酚、增效醚标准储备液配制成20、40.6080、100μg/mL并分别加人环氧七氯，使其浓度均为50μg/mL，供色谱分析使用。在1.3.4色谱条件下，分别进样3次，以浓度X（μg/mL）为横坐标，目标物平均峰面积与内标峰面积的比值Y为纵坐标，绘制工作标准曲线，并计算得出线性回归方程及相关系数。

1.3.6方法回收率及相对标准偏差的测定。分别选择未检出邻苯基苯酚和增效醚的脐橙、梨、菠萝样液作为空白基质，按1.3.1制样后，进行3种水平的标准添加回收试验。即在制备好的样液中按照25、50、100μgkg的浓度梯度分别加入邻苯基苯酚和增效醚，同时加入内标物环氧七氯，使其浓度均为50μug/mL，以1.3.2、1.3.3、1.3.4的方法进行提取、净化和上机测定峰面积，每个样品测定液重复测定5次，分别计算加标回收率和相对标准偏差。

2结果与分析

2.1标准曲线的绘制

以浓度X（μg/mL）为横坐标，目标物平均峰面积与内标物峰面积之比Y为纵坐标，绘制工作标准曲线，计算得出邻苯基苯酚和增效醚的线性回归方程、相关系数和定量下限，结果见表1。

结果表明，邻苯基苯酚、增效醚在20～100μg/mL的质量浓度范围内，其峰面积和质量浓度呈良好的线性关系，同时，通过逐渐降低分析物浓度的方法推算信噪比S/N=10时的定量下限，测得邻苯基苯酚和增效醚的定量下限均低于0.02mg/kg。

邻苯基苯酚、增效醚和内标物环氧七氯标准品的选择离子流图谱见图1。可以看出，邻苯基苯酚、增效醚和内标物环氧七氯的保留时间分别为6.754、12.705、10.450min。

2.2回收率和相对标准偏差

由表2可以看出，分别添加25、50、100μg/kg3个水平的邻苯基苯酚和增效醚于脐橙、梨、菠萝空白样品中，加标回收率范围为80.2%～107.8%（n=5），相对标准偏差范围为0.9%～2.9%（n=5）。由此可说明，该测定方法的回收率和精密度良好。

2.3提取溶剂的选择

增效醚、邻苯基苯酚呈中性至弱极性，均具有亲脂憎水特性，根据相似相容原则，常用丙酮、二甲苯、正已烷、乙腈等有机溶剂提取水果中此类物质。由圖2可以看出，乙腈的提取效果最差，二甲苯、丙酮、正已烷以及丙酮+二甲苯（体积比2：1）提取效果均较好，但丙酮提取液中由于溶出杂质较多，致使净化用时长，图谱杂峰较多，影响分析结果，故选择丙酮+二甲苯（体积比2：1）作为提取溶剂。

2.4提取方法的选择

本试验选择未检出邻苯基苯酚和增效醚的脐橙样品作为空白基质，通过加标量为50μg/kg的样品回收率和相对标准偏差考察高速分散匀浆提取法、超声波辅助提取法和振荡提取法的提取效果。

由表3可以看出，在满足精密度要求的前提下，相比于超声波辅助提取法和振荡提取法，高速分散匀浆法具有回收率高、耗时短的优点。但是在实际检测中，超声波辅助提取法可以批量处理样品，且其回收率也相对较高，故选择超声波辅助提取法作为最佳提取方法。

2.5提取时间的选择

选择超声波清洗器工作频率40kHz、电功率500W，分别超声4、8、12、16、20、24、28min提取脐橙样品中邻苯基苯酚和增效醚。由图3可以看出，样品中增效醚回收率在提取12min时基本达到峰值，邻苯基苯酚回收率在提取16min时基本达到峰值，且随着超声时间延长二者的回收率变化不大。因此，选择超声提取16min最为合理。

2.6全自动凝胶渗透净化

水果中含有一定量的有机酸、色素、多糖类、蛋白质和脂肪，在提取时不可避免地会将这些物质提取出来，而这些物质在气相色谱分析时会聚集在仪器进样口和衬管上，对进样口及衬管造成污染，同时一些杂质可能影响色谱分析的准确度。

在现行标准检测方法《食品安全国家标准水果和蔬菜中500种农药及相关化学品残留量的测定气相色谱-质谱法》（GB23200.8-2016）中使用Envi-18柱、2Envi-Carb活性炭柱、3Sep-PakNH2固相萃取柱进行样品提取液的净化。反复试验发现，该方法采用的净化方法操作繁琐，且由于各小柱串联使用不方便，导致样品净化耗时长、目标物回收率低等问题。

凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，简称GPC）技术是国际公认的农药残留分析过程中有效的净化手段一，其对于含大分子油脂、色素的样品净化十分有效，并且易于实现自动化操作，可以以大缩短样品前处理时间和减轻繁杂的人工处理过程。

3结论与讨论

本试验选用脐橙、梨、菠萝等3种水果为研究对象，确定其邻苯基苯酚、增效醚的残留量快速检测方法为：样品经粉碎后，加人丙酮+二甲苯（体积比2：1）超声波提取16min，经全自动凝胶色谱系统（GPC）净化，浓缩、定容后，用气相色谱质谱仪测定邻苯基苯酚、增效醚残留量，并以环氧七氯为内标物进行定量。结果表明，该方法的相关系数均达到0.999以上，定量下限均小于0.02mg/kg;添加25、50、100μug/kg3个水平的邻苯基苯酚和增效醚于脐橙、梨、菠萝空白样品中，加标回收率范围为80.2%～1078%，相对标准偏差范围为0.9%～2.9%。该方法经过对前处理技术的改进，优化了提取环节，缩短了提取时间，并且重现性良好，能够满足水果中邻苯基苯酚和增效醚残留量的快速分析测定。

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