抗CMV转基因辣椒实时荧光PCR检测方法研究

罗阿东　王丽平　任艳玲　蔡秋　王艳

摘要针对辣椒中转基因成分建立快速、高效、准确的实时荧光PCR检测方法，以缩短检测周期，提高检出率。结果表明，针对转基因辣椒的内源基因CaATLI和外源基因CMV建立的检测方法，具有很好的特异性，二者检测灵敏度均可达0.01%。本研究建立的检测方法特异性、灵敏度和准确度高，也比较方便快速，同时使用的是全部闭管操作，大大降低了普通PCR带来的污染，为转基因辣椒的检测提供了新的检验方法。

关键词 转基因辣椒;实时荧光PCR检测方法;CaATLI基因;CMV基因

中图分类号 S641.3

文献标识码 A

文章编号 1007-5739（2019）05-0067-03

辣椒是人们生活中必不可少的蔬菜作物，具有药理、经济、食用、营养等方面的价值。我国辣椒制品种类繁多，如油辣椒、糟辣椒、辣椒酱等，辣椒制品的多样化推动了我国辣椒产业经济的发展辣椒在世界各地广泛种植，但同时也面临着连作障碍、土壤传播疫病、生长条件产量及质量等诸多问题，人们借助转基因技术以及辣椒分子育种技术，对辣椒的生长条件、栽培技术、病虫害防治等方面进行了研究。

随着转基因作物及其产品的大规模商业化，越来越多的转基因农产品被制作成为人类消费的食品，转基因食品在传统食品市场中的份额正不断加大，逐步走上餐桌，进入人们的食物链。由于其安全性及对人类健康和生态环境的潜在威胁受到国际社会和广大民众的广泛关注B，作物转基因成分的检测越来越受到重视。

目前，对于转基因成分检测主要是针对重组DNA的核酸检测，如聚合酶链式反应（PCR），包括定性PCR、多重PCR和实时荧光PCR等。其中，实时荧光PCR作为目前主要的检测方法，有效避免了普通PCR方法存在的检测灵敏度不高、费时且容易造成交叉污染等缺点，确保了检测结果的快速、准确。

本文通过应用实时荧光PCR技术对抗CMV（Cucumber mosaic virus，黄瓜花叶病毒）转基因辣椒进行检测，旨在建立一种简便、快速的辣椒转基因成分检测方法，以期为消费者食品安全及我国农业转基因生物的监管提供有力的技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料与仪器

1.1.1材料。转基因辣椒阳性标准物质，非转基因辣椒，非转基因玉米、大豆、水稻油菜籽、番茄。

1.1.2试剂。Premix Ex Taq（Probeq PCR）（荧光PCR反应液）、MiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKit（DNA提取试剂）、引物及TaqMan探针，均购买于宝日医生物技术有限公司。

1.1.3仪器。实时荧光PCR仪（7500Fast，美国Applied Bio-systems）、高速冷冻离心机（Microfuge22R Centrifuge，美国Beckman Coulter）、超纯水仪（Milli Q，美国Millipore）核酸蛋白测定仪（Nano Drop2000，美国Thermo Scientific）、冷冻研磨仪（MM400，德国Retsch）、移液器、涡旋振荡器恒温金属浴、生物安全柜等。

1.1.4引物及探针。根据GenBank中转基因辣椒的CaATLI（Capsicumannum AT-hooklgene，编码辣椒AT一hook1蛋白基因）和CMV基因序列，利用Primer Express软件设计引物和TaqMan探针序列，弓物和探针序列及扩增长度见表1，探针和引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2试验方法

1.2.1DNA提取。取2%CTAB抽提缓冲液于65C金属浴中预热，取样品约0.3g置于冷冻研磨仪（液氮处理）研磨，加入2%CTAB抽提缓冲液700μL，轻轻搅动，将磨碎液倒人1.5mL灭菌离心管中，于65C金属浴加热振荡10min，加人5mol/L醋酸钾溶液5μL，混匀，再金属浴20min;取出离心管后放置在冰上，加人等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻来回颠倒，充分混匀;然后放人4C高速冷冻离心机中（12000r/min）离心15min，吸取上清液500μL放入另一离心管中，加入等体积的异戊醇，颠倒混匀;12000r/min离心10min后，弃上清，加入75%乙醇500μL，轻弹离心管，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中，放置30min，使DNA块状物上的不纯物溶解;12000r/min离心5min后弃去上清，加入等量75%乙醇再洗30min，12000r/min离心5min后，弃上清液，并将离心管倒立于滤纸之上，自然风干，加入50μLTE溶液，使DNA溶解，利用核酸蛋白测定仪测定样品DNA的OD260与OD280，其余于-20C冰箱冷冻保存待用。1.2.2荧光PCR反应体系。实时荧光PCR使用商品化专用荧光PCR反应液PremixExTaqP（内含经优化过的Taq酶、Mg*、dNTP）;反应体系中的引物和TaqMan探t使用推荐浓度，具体见表2。

1.2.3荧光PCR反应程序。根据引物及TaqMan探针Tm值，确定荧光PCR反应的最佳反应程序，见表3。

1.2.4特异性试验。以转基因辣椒阳性标准品以及非转基因辣椒、玉米、大豆、水稻、油菜籽、番茄的基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR检测，确定内源基因引物CaATLI和外源基因引物CMV的特异性。

1.2.5灵敏度试验。测定转基因辣椒阳性标准品DNA浓度，并对其进行10倍梯度稀释，稀释10个梯度，将稀释液用上述反应体系和程序进行实时荧光PCR检测，确定检测灵敏度。

2結果与分析

2.1DNA提取结果

提取样品总DNA，利用核酸蛋白测定仪测定样品DNA的浓度与纯度，DNA质量浓度可以达到100～200ng/uL，OD2x/OD280值在1.6～1.8之间，均达到后续试验对DNA进行分析的要求。

2.2特异性试验结果

以转基因辣椒阳性标准品以及非转基因辣椒、玉米、大豆、水稻油菜籽、番茄的基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR检测。

由图1可知，针对内源基因CaATLI，只有转基因辣椒阳性标准品和非转基因辣椒有明显扩增曲线，而其他对照物则无扩增曲线;针对外源基因CMV，只有转基因辣椒阳性标准品有明显扩增曲线，其余对照物则没有。结果表明，针对内源基因CaATLI和外源基因CMV的检测引物和探针具有较好的特异性。

2..3灵敏度试验结果

测定阳性标准品DNA浓度为240ng/μL，并对其进行10倍梯度稀释，用上述反应体系和程序进行实时荧光PCR检测，确定检测灵敏度。

由图2可知，内源基因CaATLI和外源基因CMV到了10-5稀释度（0.01%）仍然可以检测出来，形成典型的“S"形扩增曲线。其中，内源基因CaATLI在106稀释度有非典型的扩增曲线（CT值>35），在进行10次重复测试后，发现10-6稀释度扩增曲线呈现不稳定态势，表明该稀释度下的DNA含量极低，已达到方法检测极限，容易出现波动，故将其灵敏度取10-5稀释度（0.01%）。

3結论与讨论

在分子生物学的标准上，判断DNA纯度的依据是OD20/OD280的比值，符合要求纯度高的纯化DNA其0D260/OD20在1.7～1.9之间，低于此范围表示所提取的样品DNA中含有蛋白质污染，高于此范围表明样品DNA中有RNA.污染。提取的辣椒样品DNA中存在着较多的多酚、多糖，也是导致0D26/OD280比值偏低的原因之一。因此，在操作的过程中，需要注意多糖、多酚杂质的去除。

特异性试验结果表明，针对辣椒内源基因CaATLI和外源基因CMV的检测引物和探针具有较好的特异性;灵敏度测试结果表明，转基因辣椒实时荧光PCR的灵敏度小于0.01%。目前，国际上设定的转基因限量大多为1%，是本方法检测灵敏度的100倍，认为0.01%的检测灵敏度已完全能够满足基因检测的需要。

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