天冬药材基因组DNA提取方法研究

徐昌艳 雷丹丹 曹旭林

摘要 [目的]从天冬药材中提取可用于RAPD扩增的高质量基因组DNA。[方法]分别采用改良CTAB法、SDS法以及植物基因组DNA提取试剂盒法提取天冬药材基因组DNA；通过电泳、DNA浓度与纯度检测以及RAPD扩增效果确定天冬药材基因组DNA的最佳提取方法。[结果]CTAB法提取的基因组DNA较完整，DNA浓度与纯度均较高，可获得丰富的、清晰的RAPD条带。[结论]CTAB法为天冬药材基因组DNA提取的最佳方法，提取的DNA可用于天冬RAPD分析，该方法可为其他药材基因组DNA提取提供参考。

关键词 天冬；药材；基因组DNA提取；RAPD

中图分类号 S567.23 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）08-0171-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.045

Abstract [Objective]The research aimed to extract highquality genomic DNA which was used for RAPD amplification from herbal pieces such as ASPARAGI RADIX. [Method]Different methods， CTAB method， SDS method and DNA secure Plant Kit method were used to genomic DNA extract from ASPARAGI RADIX.The DNA samples obtained by the above methods were tested by agarose gel electrophoresis， concentration and purity of DNA and RAPD amplification. [Result]The more profuse and clear RAPD bands were obtained with random primers S7 by using improved CTAB. [Conclusion]CTAB method and RAPD reaction system can be used to RAPD analysis in ASPARAGI RADIX，which can provide certain reference for the extraction of genomic DNA of Chinese traditional medicine.

Key words ASPARAGI RADIX；Medicinal materials；Extraction of genomic DNA；RAPD

天冬（ASPARAGI RADIX）為百合科植物天冬Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.的干燥块根，主要含有多糖、皂苷等成分[1-3]，具有养阴润燥、清肺生津等功效，用于肺燥干咳、内热消渴、肠燥便秘、热病津伤等[4]，为乌鸡白凤丸、二冬膏、党参固本丸、冬白梅片、咽炎片等著名制剂的主要原料药材。天冬在我国分布较广泛，其主产于广西、贵州、云南等地，并以贵州产的天冬质量最好[5]。

近年来，DNA分子标记鉴定技术相对于传统经验鉴别而言，具有遗传稳定性、遗传多样性、化学稳定性等特点，被广泛用于中药基源鉴定、道地性研究、植物分类中，而快速、有效地提取高质量的基因组DNA成为中药材分子鉴定的关键。由于大多数中药资源分布较为广泛，其DNA分析标记鉴定研究材料多采用新鲜幼嫩叶片，不同分布地域新鲜幼嫩叶片采集较困难。而商品中药材多为干品，其在加工、贮藏过程中，如日晒、高温烘干等会造成DNA的降解；其次，中药材不同药用部位中的多糖、脂质、色素、酚类和其他次生代谢产物会影响基因组DNA的提取[6]。因此，该研究以市售商品药材天冬为样品进行DNA提取方法研究，以期获得高质量的商品天冬基因组DNA，为中药材分子标记技术研究提供参考依据，也为后期基于DNA分子标记鉴定技术的天冬药材质量与遗传多样性的相关性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试材 天冬药材购于贵阳市花果园药材市场和贵阳市万东桥药材市场，经贵州医科大学覃容贵教授鉴定为百合科植物天冬Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.的干燥块根，标本存放于贵州医科大学中药材质量研究室。

1.2 试剂 DP-320新型植物基因组DNA提取试剂盒（北京TIANGEN生化科技有限公司）；DNA Marker DL2000；2×Taq PCR MasterMix；GoldView Ⅰ 核酸染色剂；CTAB；SDS；β-巯基乙醇；50×TAE缓冲液；平衡酚；氯仿；异戊醇；醋酸钠；TGL-16G台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；DYY-12C电泳仪（北京市六一仪器厂）；L96G型PCR扩增仪（杭州朗基科学仪器有限公司）；Bio-Rad凝胶成像系统（美国）；电子分析天平（型号A-L-204，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；电热恒温水浴锅（型号DK-98-Ⅱ）；XH-B型漩涡混合器（江苏康健医疗用品有限公司）；无水乙醇等均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 方法

1.3.1 天冬基因组DNA的提取。

1.3.1.1 改良 CTAB 法[7-8]提取天冬药材DNA。称取天冬粉末100 mg置于研钵中，加入液氮研磨成细粉，将细粉转移至1.5 mL EP管中，加入600 μL 65 ℃预热的2%CTAB提取液和2 μL β-巯基乙醇，混匀。再加入6 μL RNA酶，上下颠倒混匀，于65 ℃水浴1 h，期间每20 min颠倒混匀1次。取出冷却至室温，12 000 r/min离心10 min，取上清液置新的离心管中，加入等体积的酚∶三氯甲烷∶异戊醇（25∶24∶1），混匀，12 000 r/min离心10 min，取上清液，加入等体积的三氯甲烷∶异戊醇（24∶1），离心10 min，取上清液，再次加入等体积的三氯甲烷∶异戊醇（24∶1），离心10 min。将上清液加入到EP管中，并加入1/3体积的NaAC溶液和1 mL -20 ℃预冷的无水乙醇，于-20 ℃放置3 h，取出12 000 r/min离心15 min，弃上清液，用75%乙醇洗涤2次，晾干乙醇，加入50 μL TE溶剂溶解DNA，置于-20 ℃保存，备用。

1.3.1.2 SDS法提取天冬药材DNA[9-10]。

取天冬药材粉末2 g，加入10% PVP，并加入适量液氮研磨。将研磨的细粉转移至5 mL 离心管中，加入65 ℃ 预热缓冲液2 mL、10% SDS 0.5 mL，混匀，至65 ℃保温1.5 h，期间每30 min颠倒混匀1次。加入1 mL 5 mol/L KAc，混匀，至冰水中冷却20 min。以10 000 r/min离心 10 min。将上清液转移至干净的5 mL离心管内，加入3 mL三氯甲烷-异戊醇（V∶V=24∶1） 去除杂质，重复3次。取上清液，加入等体积预冻异丙醇溶液，冰水冷却20 min，12 000 r/min离心10 min，沉淀用1 mL 75%乙醇洗涤，10 000 r/min离心10 min，重复洗涤2次，取沉淀，并室温放置20 min，加入50 μL TE溶剂溶解DNA，置于-20 ℃保存，备用。

1.3.1.3 植物基因组DNA提取试剂盒法。按照DNAsecure Plant Kit（DP320）说明书操作方法，对天冬干药材基因组DNA进行提取。

1.3.2 天冬药材基因组DNA的完整性检测。

用移液枪吸取8 μL CTAB法、SDS法以及试剂盒法提取的天冬药材基因组DNA置25 μL EP管中，加入2 μL 6×Loading buffer，混匀，吸取8 μL悬空加入含有GoldView Ⅰ 核酸染色剂的1.0 %琼脂糖凝胶点样孔内，以DNA Marker DL 2000 为参比，放入装有1×TAE缓冲液的电泳槽内，调电压至100 V，电泳1 h。取出，置于凝胶成像系统中显像拍照记录。根据点样孔中有无残留，电泳条带是否清晰，并与DNA Marker 进行对比，判断提取基因组DNA的完整性。

1.3.3 天冬基因组DNA浓度和纯度检测。

采用多功能酶标仪于波长260和280 nm处测定天冬药材基因组DNA的OD值即A260/A280的比值，并记录天冬基因组DNA的纯度与浓度。根据OD260/280的比值是否在1.7～1.9判断所提取基因组DNA的纯度。

1.3.4 天冬药材基因组DNA的RAPD扩增。

为进一步验证CTAB法、SDS法以及试剂盒法提取的天冬基因组DNA的质量，以RAPD随机引物S7（碱基序列：GGTGACGCAG）对各方法提取的天冬基因组DNA进行RAPD扩增[11-12]。

1.3.4.1 擴增程序。扩增程序：95 ℃预变性4 min，94 ℃变性70 s，55 ℃退火1 min，73 ℃引伸1.5 min，35个循环，73 ℃引伸10 min，4 ℃保存1 min。

1.3.4.2 天冬RAPD -PCR体系。RAPD反应体系为25 μL，即模板2 μL、引物1 μL、2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，用ddH2O补足至25 μL。

1.3.4.3 天冬RAPD-PCR产物电泳检测。

吸取10 μL“1.3.3”项下RAPD-PCR产物，悬空加入1.6%的琼脂糖凝胶（含有GoldView Ⅰ 核酸染色剂）点样孔内，以DNA Marker DL 2000为参比，以1×TAE为电泳缓冲液在100 V下电泳45 min，取出，置于凝胶成像系统上拍照、观察、记录。

2 结果与分析

2.1 天冬药材基因组DNA的完整性检测

通过对提取的天冬样品基因组DNA进行电泳检测，见图1。1、2泳道无条带产生，表明以试剂盒提取法提取天冬药材DNA的提取效果较差；3和4泳道出现条带，且条带清晰，无拖尾弥散现象，提取效果好，表明以改良CTAB法提取天冬药材的基因组DNA质量较好；5和6泳道也出现相应的条带，即SDS法亦可用于天冬药材DNA的提取，但其DNA条带的亮度较CTAB法暗，表明对天冬药材DNA的提取效果CTAB法优于SDS法。因此，初步认为天冬药材基因组DNA提取宜采用CTAB法。

2.2 天冬药材基因组DNA浓度和纯度检测

通过多功能酶标仪检测天冬基因组DNA的纯度，见表1。根据OD260/280比值判断基因组DNA的纯度，当OD260/280值在1.70～1.90时，表明提取的DNA纯度较高，质量较好；当OD260/280值低于1.70 时，表明提取的DNA中有多糖、蛋白质等杂质污染；若OD260/280值大于1.90时，表明提取的DNA有一定程度的降解或受RNA污染。根据表1比较3种方法提取的天冬DNA的浓度与OD260/280值可知，以CTAB法提取的DNA纯度较高，质量好。

2.3 天冬药材基因组DNA的RAPD扩增

以RAPD随机引物对不同方法提取的天冬样品DNA进行RAPD扩增，并对扩增效果进行比较。从图2可以看出，以CTAB法提取的2个天冬样品DNA扩增条带丰富、清晰、明亮、多态性高；SDS法提取的其中一个样品扩增条带较少，且有模糊的二聚体存在；以试剂盒提取法的扩增效果最差，仅得到一些相对分子质量小的条带。综上检测结果，将CTAB法确定为天冬药材基因组DNA提取的最佳方法。

3 讨论与结论

中药材药用部位大多是老化的组织，其中含有大量的多酚和多糖类物质，尤其是天冬药材中多糖含量很高，这对提取其基因组DNA造成严重干扰。由于植物细胞在死亡过程中，也会产生某些次生物质与DNA形成复合物降低DNA的溶解度或使其产生不同程度的褐变。而对于市售药材多经过加工或简单粗加工，因此药材中DNA可能受日晒、烘干等加工方式的影响产生不同程度的降解。这些因素均使提取药材中的DNA变得困难。故寻找一种方便、快速且适合药材基因组DNA提取的方法显得尤为重要[6]。