米象GST基因的表达及其对磷化氢的应答

叶侃 胡飞 魏兆军

摘要分析米象代谢解毒相关基因谷胱甘肽硫转移酶（GST）的表达，获得米象基因遗传信息，进而从本质上全面揭示米象的磷化氢抗性。米象敏感品系经磷化氢不同浓度熏蒸和不同时间熏蒸处理，2个基因经LC30浓度磷化氢熏蒸的相对表达量显著高于其他2个浓度；4个GSTs基因经LC50浓度磷化氢熏蒸的相对表达量显著高于对照组和LC30、LC10处理组；3个基因相对表达量均显著低于对照组。7个GSTs基因随着熏蒸时间的增加，相对表达量逐渐升高。米象GSTs基因在不同发育阶段的相对表达模式中，SoGSTd1基因在四龄幼虫阶段的相对表达量最高；SoGSTe1基因在成虫阶段的相对表达量最高；SoGSTe2和SoGSTe5基因在四龄幼虫阶段的相对表达量最大，SoGSTe6基的相对表达量在三龄幼虫阶段最大。米象13个GSTs基因在不同组织部位的相对表达模式中。米象13个GSTs基因中的11个在中肠、脂肪体或马氏管中的相对表达量均显著高于头部和表皮中的表达量。

关键词 米象；谷胱甘肽硫转移酶；磷化氢；基因表达

中图分类号S433.5文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）08-0114-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.029

AbstractThrough transcriptome technology，several resistant genes related to S.oryzae such as glutathione Stransferase，cytochrome were analyzed and the transcriptome genetic information was obtained，revealing the resistance of insects in nature at transcriptome level is gaining a huge interest among the researchers.The S.oryzae sensitive strains of different concentrations of phosphine fumigation and fumigation treatment at different time were investiagted.The concentration of two genes was significantly higher than the other two concentrations by the concentration of LC30，and the relative expression of the four GSTs genes was significantly higher than that of the control group and the LC30，LC10 treatment group，and the relative expression of the three genes was significantly lower than that of the control group.The relative expression level of 7 GSTs genes increased gradually with the increase of fumigation time.The relative expression of the SoGSTd1 in the fourinstar stage was the highest in the relative expression pattern of the GSTs gene in the different developmental stages，and the relative expression of the SoGSTe1 gene in the adult stage was the highest.The relative expression of the SoGSTe2 and SoGSTe5 genes in the four instar stage was the largest，and the relative expression of the SoGSTe6 gene in the three instar larvae was maximum.13 GSTs genes of S.oryzae were differently expression in different tissues.The relative expression level of 13 GSTs genes in midgut，fat body or malpighian tubules in S.oryzae was significantly higher than that in the head and cuticle.The relative expression level of 11 genes in the midgut，fat body or malpighian tubules was higher than that in the head and cuticle.

Key wordsSitophilus oryzae；Glutathione Stransferases；Phosphine；Gene expression

米象（Sitophilus oryzae）屬于鞘翅目，象虫科，是一种完全变态昆虫。它有卵、幼虫、蛹、成虫4个发育形态，是贮藏谷物的主要害虫之一，主要寄生在贮存2～3年的陈粮中，例如玉米、水稻、小麦、高粱等谷物中，成虫在外部啃食谷物颗粒，幼虫则寄生在谷物内部蛀食[1]。由于其地理分布遍布全世界，生长繁殖速度快，因此对贮藏谷物危害严重[2]。在我国，米象主要生长在南方地区。

我国在1960年就为了防治储粮害虫，开始使用磷化氢熏蒸剂，由于磷化氢具有成本低、使用便捷、持续时间长、无明显残留以及对绝大多数害虫、鼠类的杀虫效果明显等优点而被广泛应用，至今仍没有出现比它更高效的熏蒸剂替代物[3]。到了90年代中期，由于熏蒸剂磷化铝的长期使用，一些储粮害虫产生了一定的磷化氢抗性[4]。根据调查，储粮害虫的磷化氢抗性品系从20世纪60年代的3种发展到31种，尤其在米象、谷蠹和扁谷盗中出现了对磷化氢的高抗性品种[5]，在印度發现的高抗性米象品系，其LC50已经达1.7 mg/L（熏蒸20 h）[6]。我国研究人员于1988年测定了29种米象，其中12种具有抗性，抗性品种约占40%；1992年测定的37个品系中有26种为抗性品种，占比超过70%[7]。2004年对21种米象进行研究，13种米象被发现具有磷化氢抗性[8]。研究表明，2005年我国发现1种磷化氢抗性米象，LC50已经达 6.313 mg/L，为敏感品系的1 034倍[9]。结合这些数据，说明米象产生抗药的品种越来越多，并且抗药性越来越强。

细胞色素P450、谷胱甘肽S-转移酶和乙酰胆碱酯酶是昆虫体内的三大解毒酶。多年来，已开展了广泛的抗性机制研究，结果表明昆虫抗药性的产生有不同的机制，已公认的包括对杀虫剂暴露的减少、对杀虫剂代谢的增强以及靶标部位敏感性的降低等[10]。

真核生物拥有多种谷胱甘肽硫转移酶（GST）的不同催化活性，以适应广泛的酶家族功能[11]。生物体都具有一套精细的防御体系来抵抗外来和内源有害物质。在该体系中，GSTs的作用十分重要，它常在极端条件发挥抗氧化及解毒作用，从而对生物体起保护作用[12]。GSTs 的功能非常多样，主要表现为以下3 个方面：①分解异源有毒物质；②对细胞具有还原作用；③对内源代谢物和外源化合物进行细胞间运输[13]。

最早，GSTs是在大鼠中被发现具有活性[14]。近来，对于哺乳动物和昆虫GSTs 的研究报道越来越多，并且对昆虫GSTs 基因家族的结构、功能和进化进行了综述，如针对冈比亚按蚊（Anopheles gambiae），克隆得到其GSTs 基因28 个，并且已经完成对其测序[15] 。在一些有机磷杀虫剂产生抗性的家蝇中，发现了GSTs 水平上升[16]。研究GSTs与杀虫剂抗性的关系对防治储粮害虫有重要的理论和实践意义[17]。昆虫GSTs的研究焦点主要集中于杀虫剂抗性。在果蝇和家蝇中证实了GSTs基因与磷化氢抗性有关，按蚊中也发现了磷化氢抗性有关的基因，过量表达的重组按蚊GSTs基因产物在体外能催化磷化氢降解，大规模全基因组测序的完成使得果蝇和按蚊的GSTs研究迅速发展[18]。

目前已经从二十多种昆虫中克隆得到了近百个GSTs 基因序列。它们分别属于至少3个类别：Ⅰ 类GSTs基因被划分为Delta，属于昆虫特有的GSTs[19]。2007年，国内发现了家蚕中1个由220个氨基酸组成的GST，其结构与果蝇和按蚊中相似，同属Delta类[20]；Ⅱ 类GSTs基因包括Theta、Sigma、Omega和Zeta类；Ⅲ 类GSTs 基因也是昆虫特异性的，称为Epsilon类。除了这三大类以外，有人认为果蝇中还存在第4类GSTs 基因[21]。此外，昆虫GSTs 基因的表达调控也取得了初步进展。其中双翅目昆虫GSTs 基因水平的研究报道最多，其次是鳞翅目昆虫，其他种类的昆虫研究很少[22]。笔者分析了米象代谢解毒相关基因谷胱甘肽硫转移酶的表达，获得了米象基因遗传信息，进而从本质上全面揭示米象的磷化氢抗性。

1材料与方法

1.1供试昆虫处理

1.1.1供试昆虫。试验所用的米象材料采集自河南工业大学农产品储藏实验室。饲养条件为（27±1）℃，相对湿度为（70±5）%。将采集到的米象按不同的虫态（卵、幼虫、蛹、成虫）分别放置，收集试虫，每个虫态收集300头，装入灭菌后的EP管中，放入-80 ℃冰箱中保存备用。米象成虫饲养于广口瓶中，用棉布封口，以上述同样条件在培养箱中培养，以备进行后续试验。

1.1.2磷化氢气体的制备。磷化氢气体是由磷化铝与10%的稀硫酸反应制备的，磷化氢浓度用钼兰比色法测定。磷化氢用密封式注射器注射入盛有试虫的特制的真空干燥器中。

1.1.3抗性测定。使用联合国粮农组织（FAO）方法熏蒸处理20 h（25 ℃、70%RH）。处理的试虫从干燥器中取出后放置在养虫室内饲养14 d，检查死亡状况，计算死亡率。

1.1.4受试米象的逆境处理。

1.1.4.1不同浓度磷化氢处理。用不同的熏蒸室，磷化氢浓度分别设置为LC50：0.039 mg/L、LC30：0.030 mg/L和LC10：0.005 mg/L，每种浓度设2 个平行。

1.1.4.2不同熏蒸时间处理。将磷化氢浓度统一设置为LC30：0.030 mg/L，熏蒸处理时间设置为12、24、36和48 h，每个时间设2个平行。

1.1.5数据处理。数据是用SPSS软件进行分析处理和统计。

1.2米象转录组分析通过Solexa RNA 的paired-end 测序方法对各试验样品进行测序，将最短的reads片段从头组装成转录组。将得到的Unigene与数据库中编码已知功能蛋白的基因序列进行比对，鉴定出GSTs，细胞色素P450以及EST基因。

1.3RACE反应获得米象代谢解毒基因全长

1.3.1设计RACE引物。根据上一步获得的米象代谢解毒基因部分中间片段，分别设计5′RACE和3′RACE特异性引物，扩增5′末端和3′末端全长序列，并预测长度。

1.3.2合成5′RACE和3′-RACE-Ready cDNA模板。为了获得RACE-Ready cDNA模板，准备3′-RACE-Ready cDNA合成反应体系，共需要2个反应管，每管均为10 μL反应体系。

米象13個GSTs基因在不同组织部位的相对表达模式如图3所示。米象13个GSTs基因中的11个（SoGSTd1、SoGSTe1、SoGSTe2、SoGSTe3、SoGSTe4、SoGSTe5、SoGSTe6、SoGSTs1、SoGSTs2、SoGSTs3、SoGSTs4）在中肠、脂肪体或马氏管中的相对表达量均显著高于头部和表皮中的表达量；SoGSTe6、SoGSTs2和SoGSTt2基因在表皮中的相对表达量最低；仅SoGSTt1基因在米象5种组织部位中的相对表达量均无显著性差异。

3结论与讨论

克隆获得米象GSTs基因全长序列13个。根据序列的相似性和进化关系，将其中的6个基因归类于Epsilon家族，4个基因归类于Sigma家族，2个基因归类于Theta家族，另归类于Delta家族1个。米象GSTs基因中共鉴定出6个Epsilon家族的基因。米象GSTs基因中没有鉴定出Omega、Zeta和Unclassified家族的基因。

米象敏感品系经磷化氢不同浓度熏蒸和不同时间熏蒸处理。3个GST基因经不同浓度的磷化氢熏蒸后的相对表达量均无显著性差异；2个基因经LC30浓度磷化氢熏蒸的相对表达量显著高于其他2个浓度；4个GSTs基因经LC50浓度的磷化氢熏蒸的相对表达量显著高于对照组和LC30、LC10处理组；3个基因相对表达量均显著低于对照组。GSTs从总体上来看，表达量受熏蒸时间和剂量的影响，且与时间、剂量呈正相关。总体上来说，随着米象生长发育，GSTs表达量逐渐增加。

在不同组织部位上，中肠、脂肪体或马氏管中的相对表达量均显著高于头部和表皮中的表达量。7个GSTs基因随着熏蒸时间的增加，相对表达量逐渐升高；1个GSTs基因的相对表达量均显著低于对照组。米象13个GSTs基因在不同组织部位的相对表达模式中。米象GST基因成虫阶段的相对表达量最高，在四龄幼虫的相对表达量其次。

米象11个GSTs基因在中肠、脂肪体或马氏管中的相对表达量均显著高于头部和表皮中的表达量。

通过对米象GST基因的分析，不仅发现了米象进化中的亲缘关系，而且揭示了米象相关的抗药性基因的分子机理，对抗性昆虫产生的原理做出进一步阐释，为新药物的开发提供了指导。同时，扩充了米象的遗传信息资源，为以后米象转录组的研究打下基础。该研究选取米象中的GST基因进行系统分析，可以假设，建立抗性基因数据库，一方面可以研究昆虫的种间关系，另一方面，对综合治理昆虫抗药性以及维持生态平衡都有积极的意义。

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