我国不同地区小鼠Y染色体Zfy1基因遗传差异分析

陈梦璇 于立强 靖美东

摘要[目的]对我国5个地区小鼠Zfy1基因进行遗传差异分析。[方法]通过对5个地区79个雄性小鼠样品进行DNA提取，PCR扩增后进行序列测定和分析。使用MEGA6.0和DNAsp等软件对获得序列进行分析，计算遗传距离，构建系统发育树。[结果]5个地区Zfy1基因碱基组成基本一致，碱基的平均含量为A 25.1% 、T 39.6 % 、G 20.8% 、C 14.4 %，呈现出明显的AT偏向。79个样品共定义为13个单倍型，各单倍型间遗传距离小，无明显差异。以大鼠（GATN01000010）为外群，小鼠（NM_009570）为参照构建系统发育树，13个单倍型均处在同一分支上，无明显分化现象。[结论]我国南北方各地区间小鼠Zfy1基因无明显分化现象，基因差异性较小，具有极高的保守性。

关键词小鼠；Y染色体；Zfy1基因；遗传差异

中图分类号Q75文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）08-0090-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.023

Abstract[Objective] To analyze the genetic difference of Zfy1 gene in 5 regions of China. [Method] DNA was extracted from 79 male mouse samples in 5 regions， and the sequence was determined and analyzed after PCR amplification. MEGA6.0， DNAsp and other software were used to analyze the sequences， and the genetic distance was calculated and the phylogenetic tree was constructed. [Result] The base pair composition was consistent among 5 regions. The average contents of the bases were 25.1% A， 39.6% T， 20.8% G， and 14.4% C， showing a significant AT bias. A total of 79 samples were defined as 13 haplotypes， and there was no significant difference in genetic distance of each haplotype. The phylogenetic tree was constructed with rat GATN01000010 as the outgroup and mouse （NM_009570） as reference. 13 haplotypes were clustered into the same branch， without obvious differentiation. [Conclusion] There was no obvious differentiation of Zfy1 gene in mice from north to south in China， and the genetic difference was small， Zfy1 gene had high conservation.

Key wordsMice；Y chromosome；Zfy1 gene；Genetic difference

小鼠（Mus musculus）隶属啮齿目（Rodentia）鼠科（Muridae）小家鼠属（Mus）[1]，体型较小，一般情况下其体长为70～75 mm，体重7～20 g，尾长略短于身长或与体长相当，背部通常呈灰棕色或灰褐色，腹部毛色为白色。小鼠是一种重要的模式生物，在医学和生物等领域均被广泛利用[2-6] 。目前关于小鼠的起源及分布主要有2种模型。一种为离心模型（centrifugal model）[7]，研究者通过蛋白质电泳线粒体DNA分析，印度及其附近地区的小鼠与欧洲和亚洲边缘种群相比有更高水平的遗传多态性。因此，提出小鼠起源于印度北部，然后分别向西、向北和向东幅射扩张形成M.m.domesticus、M.m.musculus和M.m.castaneus 3个亚种[7]。另一模型是在20世纪90年代末提出的，被称为顺序模型（sequential model）或线性模型（linear model）[4]，认为原始的小鼠是domesticuslike这一亚种，起源于亚洲西部及中部这一区域。domesticuslike种群最初生活在亚洲的底格里斯河和幼发拉底河流域附近，随着人类活动的迁徙，逐渐向南迁移到达阿拉伯半岛南部地区，然后向东、向北进入亚洲印度次大陆，形成了castaneusmusculus种；最后castaneusmusculus种在亚洲大陆内部进行了分化，形成现今的3个亚种[8-9]。我国小鼠主要有2个亚种：一是北方亚种（M.m.musculu），二是南方亚种（M.m.castaneu）。

哺乳动物的性别由性染色体决定，在以往的研究中发现性染色体是由1对长度相同的染色体进化而来的[10]。在进化过程中Y染色体逐渐退化，且Y染色体上丢失的基因数量约为X染色体上的2倍[11]。Y染色体由长臂和短臂组成，长臂上逐渐形成的雄性特異区（MSY）是非重组区域，不会与X染色体发生重组，但可发生自身重组，因此Y染色体有高度进化、执行雄性特异功能的特点[12-15]。

ZFY基因是位于Y染色体上的一个特异性基因，其作用是与X染色体上的ZFX基因构成1对等位基因，用以编码锌指蛋白[16]，ZFY基因有更高的突变率、遗传变异程度较高等特点[17-18]。20世纪80年代末，Affara等[19]通过对ZFY基因的序列分析及精确定位，提出人类Y染色体上的锌指蛋白基因定位即小鼠Y染色体上的Zfy1和Zfy2基因，通过比对发现Zfy1基因与人类有较高的同源性。小鼠ZFY基因位于Y染色体短臂，包含11个外显子和1个随机重复区域“锌指”结构，“锌指”结构由2个组氨酸和2个半胱氨酸构成[20-21]。在减数分裂时期，Zfy1基因在减数分裂性染色体粗线期失活，并在减数分裂性染色体失活时期起主导作用[21]。笔者对我国5个地区共79只雄性小鼠Zfy1基因进行序列分析与比较，以GenBank中褐家鼠（Rattus norvegicus，GATN01000010）为外群，M.m.musculus（NM_009570）为参照进行单倍型定义及系统发育树构建，以期为我国小鼠亚种分布及进化提供理论依据。

1材料与方法

1.1样品采集与保存

在全国多个地区使用捕鼠夹或鼠笼进行样品采集。捕获后的小鼠样品根据Corbet等[22]的物种描述进行鉴定。野外采样后，选取小鼠适量肌肉组织或剪切适量尾部保存于无水乙醇中，带回实验室后在低温条件（-80 ℃）下保存。采集样品覆盖全国各地区，共79个小鼠样品，每个地区样品均在5个以上。

1.2方法

1.2.1DNA提取。

将采集的样品组织剪取适量置于1.5 mL离心管中，充分剪碎研磨，后续使用Promega试剂盒进行总DNA的提取。使用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA检测，并将提取的DNA置于冰箱中冷冻保存，备用。

1.2.2PCR扩增。

设计引物由上海生工生物工程有限公司完成，并根据实际情况，调整退火温度。在该试验中通过梯度PCR确定扩增Zfy1基因的最适退火温度为57 ℃，退火时间30 s。PCR反应体系（50 μL）如下：0.5 μL模板DNA，引物各1 μL，25 μL Premix Taq，22.5 μL双蒸水。PCR反应程序如下：94 ℃预变性3 min；94℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min；温度降至室温，10 ℃下保存。

1.2.3序列处理及分析。

将PCR扩增产物送至上海生公进行纯化与测序。将测序结果使用Chromas软件确定使用片段。确定无误后，使用Seqman软件进行序列剪切与拼接。最后，将每条序列进行BLAST检测，确定为小鼠DNA序列。利用MEGA软件，将所有序列整合比对。利用MEGA6.0、Dnasp 4.0和DAMBE等软件进行后续序列分析。

2结果与分析

2.1各地区碱基含量

将得到的79个序列导入MEGA 6.0软件比对对齐后，剪切了609 bp的基因片段用于分析。对各地区间序列碱基组成分析结果见表1。由表1可知，在各地区间碱基差异不明显；5个地区的样品均表现出明显的AT碱基偏向，这一现象在以往的小鼠基因分析研究中也被发现，在哺乳动物中是普遍现象。

2.2单倍型组成

将全部序列导入至DAMBE中进行单倍型定义及分析。79个样品中共发现10个变异位点[variable （polymorphic） sites，V]，其中单态位点（singleton variable sites，S）3个、简约性信息位点（parsimonyinformative sites，Pi）7个，共定义了13个单倍型，分别为H1 HN44；H2 XJ2243，XJ1374，XJ2245；H3 XJ2248；H4 XJ1358；H5 XJ1364，XJ1343，XJ1372，XJ1359，XJ1327；H6 SH40，XJ1320；H7 XJ1348，XJ1322，XJ1338，XJ2227，XJ1354，XJ1335，XJ1374，XJ1329，XJ1337，XJ1380，XJ1321，XJ1373，XJ1319，XJ1375，XJ1333，XJ1317，XJ1324，XJ1328，XJ1376，XJ1356；H8 MH58；H9 MH47；H10 MH62；H11 YM56；H11 HN29，HN24，HN40，SH15，SH2，SH6，SH30，SH33，SH26，SH4，MH56，MH50，MH51，MH43.2，YM39；H13 HN26，HN34，HN22，HN21，HN1，SH14，SH18，SH8，SH10，SH7，SH13，SH39，SH41，SH45，SH19，SH17，MH37，MH49，MH43，MH44，MH51，MH46，YM69，YM78，YM6，YM59。其中，共享单倍型有3个，分别为H6、H11、H13，主频单倍型为H13，由26个序列组成。

2.3单倍型遗传距离

将5个地区共79个小鼠样品所定义的13个单倍型与GenBank中下载的小鼠Zfy1基因序列为参照，以褐家鼠序列为对比进行单倍型间遗传距离分析。由表2可知，各单倍型间的遗传距离较小（0.000～0.008），由此可知单倍型间小鼠Zfy1基因并没有明显的差异，遗传分化较少。将5个地区间的小鼠Zfy1基因序列进行遗传距离分析，结果见表3。由表3可知，5个地区小鼠Zfy1基因并无明显差异，南北方小鼠并没有出现明显的遗传分化现象。

2.4系统发育树分析

Y染色体上的基因由于其特殊的形态结构和其本身的退化机制等原因具有较强的保守性。该研究以褐家鼠为外群，以小鼠为参照构建系统发育树，结果如图1所示。由图1可知，13个单倍型均在同一大分支上，并没有明显的分支现象。13個单倍型均与小鼠在同一分支上，表明13个单倍型间没有明显的分化现象。

3结论

长久以来，我国小鼠的亚种分布及迁徙路线问题一直是我国小鼠相关研究者的关注热点之一。笔者对我国南北方5个地区共 79个小鼠样品进行DNA提取及后续序列扩增分析，发现扩增到的Zfy1基因序列片段在609 bp左右，79个样本共定义了13个单倍型。各单倍型之间碱基组成差异不大，通过计算各单倍型之间遗传距离与各地之间种群遗传距离可知，小鼠Zfy1基因序列较为保守，并无明显分化现象。以GenBank M.m.musculu的Zfy1片段为参照，以褐家鼠Zfy1基因序列为外群进行系统发育树构建。结果显示，13个单倍型均聚在同一分支上，说明由于Y染色体在进化过程中严格遵循父系遗传，进化过程极度保守，我国南北方小鼠Y染色体Zfy1基因无明显遗传分化现象。

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