胃腺癌组织中CCAR1 mRNA、蛋白表达及其意义

吕蓉蓉 齐洁敏

(承德医学院病理教研室，河北 承德 067000)

胃癌是高发的恶性肿瘤之一，发病率在不同区域间存在较大差异，但中国的发病率依然居于世界首位〔1〕。胃腺癌是胃癌常见的一种类型，病人预后较差，死亡率也比较高，其发生、发展过程涉及多种调控机制，主要与原癌基因的异常激活、肿瘤抑制基因失活和凋亡调控基因异常表达有关〔2〕。最近发现了一种重要的细胞凋亡调控基因细胞周期和细胞凋亡调控蛋白(CCAR)1，可与多个细胞周期及细胞凋亡调控蛋白相互作用，共同调控细胞的凋亡信号，促进发生细胞凋亡或抑制细胞生长，它在细胞增殖和凋亡的调节中起重要作用〔3〕。目前国外关于CCAR1在胃癌中的表达情况鲜有报道，国内关于其在胃腺癌组织中的表达也未见报道。本实验旨在探讨胃腺癌组织中CCAR1 mRNA和蛋白的表达及其与临床病理参数的关系。

1 资料与方法

1.1组织标本 收集在承德地区多所医院近2年行手术治疗的胃癌患者组织标本60例，后经病理诊断为胃腺癌，胃癌患者手术前均未行放化疗，年龄41～85岁，高分化28例，中分化19例，低分化13例；同期选择40例邻近的癌旁正常胃黏膜组织(距离胃癌组织边缘>5 cm)，包括女15例、男25例，年龄35～78岁。

1.2免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP)法检测CCAR1蛋白 将所收集的样品用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，以5 μm厚度连续切片。采用免疫组化SP法及二氨基联苯胺(DAB)显色法检测CCAR1蛋白的表达，并按说明书进行实验操作。CCAR1抗体购自联科生物公司，使用浓度为1∶200。阳性对照切片使用确定具有阳性表达的切片，空白对照切片使用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗进行实验。由两位高年资的病理医师通过双盲法按照先低倍后高倍的顺序在显微镜下观察切片并进行诊断，每个部分随机选择4个高倍下视野(×400)进行统计分析，根据染色强度和阳性细胞比例来确定实验结果。染色程度：0分为未着色、1分为淡黄色、2分为棕黄色、3分为棕褐色；染色细胞所占的比例：0分为阳性细胞数<5%，1分为≥5%且<25%，2分为≥25%且<50%，3分为≥50%。将上述两项得分相乘得到最终结果：0～1分即CCAR1蛋白阴性表达，≥2分即阳性〔4〕。

1.3Western印迹法检测CCAR1蛋白 所收集新鲜标本长期储存于-80℃低温条件下，实验时称取约0.1 g新鲜组织，加入1 ml细胞放射免疫沉淀法(RIPA)裂解缓冲液后充分研磨、裂解，提取组织中的总蛋白，并按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒的要求对所提蛋白的浓度进行检测，取30 μg蛋白上样量并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。内参β-actin抗体浓度为1∶3 000，兔抗人CCAR1抗体浓度为1∶1 500，4℃过夜。次日加入二抗，浓度为1∶14 000，孵育后应用电化学发光法发光液进行显影并采集图像。利用Image J软件分析实验条带的灰度值，以靶蛋白条带与内参条带灰度值的比率作为靶蛋白相对表达量。

1.4实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测CCAR1 mRNA 将0.1 g组织置于已除去核糖核酸酶(RNase)的EP管中，按照说明书提取组织中的总RNA。将总RNA提取剂(TRIzol)加入新鲜组织中，放入组织研磨仪充分研磨提取组织总RNA，检测RNA浓度并反转录成cDNA，进行qRT-PCR。CCAR1基因引物序列上游为5′-GCTATTCGTTGTAAGGCTCTG-3′，下游为5′-TCTCCACATGAGCTGGAACTGTA-3′。内参GAPDH的引物序列上游是5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游是5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。按照试剂盒要求将引物、cDNA等加入无酶EP管中轻弹混匀，通过qRT-PCR获得靶基因及内参的Ct值，与正常胃黏膜相比，胃腺癌组织中靶基因表达的倍数以2-△△Ct表示。每例标本设3个复孔，重复3次试验后取平均值。

1.5统计学分析 采用SPSS19.0软件进行χ2检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1CCAR1蛋白和mRNA的表达与临床病理参数的关系 CCAR1蛋白阳性率、CCAR1蛋白和mRNA的表达与胃腺癌患者的年龄、性别和淋巴结转移、浸润深度、TNM分期无关(P>0.05)，与胃腺癌的分化程度有关(P<0.05)，见表1。

表1 CCAR1蛋白阳性率、蛋白和mRNA的表达与临床病理参数的关系

1)P<0.05

2.2免疫组化SP法实验结果 CCAR1蛋白的阳性表达主要出现在细胞核，但也可见于胞质中，在胃腺癌组织中的CCAR1蛋白阳性率〔81.6%(49/60)〕显著高于正常胃黏膜组织〔32.5%(13/40),P<0.05〕，见图1。

2.3Western印迹实验结果 在胃腺癌中，CCAR1蛋白相对表达量(1.82±0.15)显著高于邻近的癌旁正常胃黏膜(0.50±0.09,P<0.05)，见图2。

2.4qRT-PCR实验结果 在胃腺癌组织中，CCAR1 mRNA的相对表达量(3.28±1.21)显著高于正常胃黏膜(0.94±0.18,P<0.05)。

图1 CCAR1蛋白的表达(SP法，×400)

图2 CCAR1蛋白的表达情况

3 讨 论

根据最新的统计结果显示，我国每年新发癌症约429万例，占全球新发病例总数的20%，肿瘤的预防已成为我国亟待解决的重要问题〔5〕。胃腺癌的早期症状不典型，待其出现明显症状与体征时多已属中晚期，分化程度差，预后不佳。胃腺癌的发生是多方面因素综合作用的结果，其发病机制涉及众多基因和分子信号通路〔6〕，不仅涉及肿瘤细胞的异常增殖，也与细胞凋亡的抑制存在密切关系。

细胞凋亡是凋亡相关基因在某些生理和病理条件下调控的细胞主动死亡的过程。CCAR1蛋白是一种核内磷酸化蛋白，最早被发现其可以介导化疗药物引起的人类乳腺癌细胞的凋亡，它以基因特异性的方式发挥作用，并在不同的靶基因上发挥不同的作用机制〔7〕。在Wnt通路中，CCAR1可以共激活β-连环蛋白(catenin)，并协助β-catenin促进Wnt通路中的下游基因包括癌基因c-myc、细胞周期蛋白D1、基质金属蛋白酶(MMP)-7等表达；CCAR1与泛素连接酶(APC/C)亚基APC-2结合发生相互作用，并与细胞分裂周期蛋白20、上皮-钙黏连素1共激活APC/C；而在CCAR1功能模拟物存在的情况下，CCAR1与APC-2结合受到抑制并阻止细胞进入G2/M期，促进激活Caspase泛素蛋白酶途径，导致CyclinB1蛋白缺失，从而控制细胞的生物学活性，调控细胞的周期〔8〕。CCAR1诱导细胞凋亡，可以通过与肿瘤抑制基因P53的结合及调节周期蛋白依赖性激酶(CDK)1和细胞周期素依赖性激酶抑制因子的水平作用于转录调控过程，它还可以作为促凋亡信号来调节细胞周期以促进细胞的凋亡〔9〕。研究揭示了CCAR1参与多种细胞类型包括不同癌细胞的细胞增殖及凋亡信号传导，通过与相应的细胞周期调控蛋白及细胞凋亡调控蛋白结合，来调节细胞增殖与凋亡信号，并发挥了重要作用〔10〕。Seo等〔11〕研究显示，在前列腺癌组织中CCAR1 mRNA和蛋白与正常前列腺组织相比表达增加，其表达异常升高可引起前列腺癌细胞对凋亡产生抑制，从而导致了前列腺癌的发生；在肝细胞癌〔12〕的相关研究中发现，CCAR1蛋白在肝细胞癌中表达量增加，并促进了肝细胞癌的肝内转移及微血管浸润。还有研究表明在肺癌的治疗过程中，CCAR1的表达量下调〔13〕，提示其表达量的升高或与肺癌的发生具有一定的关系。

本研究结果显示CCAR1 mRNA、蛋白的相对表达量随着胃腺癌分化程度的不断降低均出现明显增加。在基因水平和蛋白水平上CCAR1在胃腺癌组织中表达增高与CCAR1在其他肿瘤中的研究结果一致，说明其在胃腺癌的发生过程中具有重要的促进作用，并可能与胃腺癌的进展有关。

随着基因组学和蛋白质组学技术发展，人们在明确肿瘤的发生和分子机制方面取得了一定的进展，对于肿瘤的治疗也有一定的突破。但是，许多抗癌治疗成功结果往往是短暂的，很大一部分原因是治疗药物的毒副作用及出现耐药性癌症。因此，有必要不断发现肿瘤发生过程中异常表达的因子和分子途径，以便开发新的治疗策略。CCAR1 mRNA、蛋白在胃腺癌组织中表达升高，对细胞凋亡发挥了一定的抑制作用并促进了胃腺癌的发生。随着CCAR1表达增加，胃腺癌细胞的凋亡减少，提示CCAR1在一定程度上可作为分子生物学标记来判断胃腺癌的发生。后期可进一步研究CCAR1的表达机制，或可为胃腺癌的精确诊断及靶向治疗提供新的思路。