大麦属植物Epichloë属内生真菌研究进展

周景乐，陈泰祥，陈水红，李春杰

（兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室 / 兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室 /兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020）

大麦属(Hordeum)植物是重要的粮食作物、牧草和耐盐碱植物资源[1]。该属植物中，大麦(H.vulgare)和青稞(H. distichon var. nudum)是主要的栽培种，大麦是仅次于玉米(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)以及水稻(Oryza sativa)的粮食作物[2]，青稞则是青藏高原最具特色的农作物，是我国藏区农民的植物性粮食来源[3]；其余大麦属植物多为野生种，作牧草用，由于野生大麦属植物多具有优良的饲用品质以及耐盐碱品质，以耐盐碱和改善牧草营养品质为育种目标的野大麦人工选育工作一直在进行着[4-6]。

Epichloë属内生真菌属于子囊菌门(Ascomycota)麦角菌科(Clavicipitaceae)，其传播方式可分为垂直传播和水平传播。只进行垂直传播的内生真菌，其整个生活史在宿主内部完成，宿主外部不显示任何症状；进行水平传播的内生真菌可在宿主花序上产生子座，使宿主无法生产种子[7]。自然界中，进行水平传播的内生真菌通常比垂直传播的内生真菌分布广泛[8]。国外学者在1898年首次从毒麦(Lolium temulentum)中分离到内生真菌, 之后逐渐发现高羊茅(Festuca arundinacea)和多年生黑麦草(L. perenne)对家畜的致毒作用与内生真菌的存在有关[9-10]。随着研究的深入，内生真菌对禾草的积极作用逐渐被人们发现。内生真菌产生的生物碱虽然对家畜有毒，但对害虫也有一定的抑制作用[11-12]。而且，内生真菌不仅仅依靠生物碱来帮助植物抵御昆虫的侵害，还可以诱导植物的免疫，通过影响宿主植物激素的生成，来改善植物的生长状况[13]。内生真菌的存在还利于抑制杂草生长，提升宿主自身的竞争力[14]。除了能够增强植物对生物胁迫的抗性以外，内生真菌有利于改善宿主禾草对高温、干旱、水淹和贫瘠等非生物胁迫的抵抗能力[15-18]。为此针对大麦属植物，从内生真菌带菌率、分类、提高宿主抗逆性及其应用等方面进行综述，旨在为大麦属内生真菌共生体的后续研究及利用提供指导。

1 大麦属植物的分布和利用方式

1.1 分布

大麦属植物在全世界大约有29种，多分布于全球温带或亚热带的山地或高原地区。29种植物中，有13种产自南美洲，6种产自亚洲，5种产自北美洲，4种产自欧洲，1种产自非洲[19]。该属植物种的分布范围比较广泛，种间分布区多有重叠现象，如芒颖大麦(Hordeum jubatum)和短药大麦(H. brachyantherum)在白令海峡两侧的亚洲东北部和北美洲的西部呈间断式分布，而海大麦(H. marinum)最初在地中海有分布，现在美洲以及大洋洲亦有发现，已成为世界广布的杂草[19]。大麦属植物中除了分布广泛的植物外，也有一些分布区域较狭窄的特有植物，如美国加利福尼亚洲西南部的一年生大麦属植物圣迭大麦(H. intercedens)和中国内蒙古的内蒙古大麦(H. innermongolicum)[19]。

中国大约有15种大麦属植物，其中6种产自中国，其余为外来物种[19]。在我国土著物种中栽培类群和近缘野生类群没有自然分布，其他野生植物均分布于牡丹江、沈阳、天津、西安和成都线以西的广大地区。在国产种中，内蒙古大麦的分布区最为狭窄，仅在内蒙古锡林格勒盟的宝格达山有分布。分布区域最广的是短芒大麦(H. brevisubulatum)，在吉林、内蒙、河北、山西、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆和西藏均有分布[19]。

1.2 利用方式

大麦属植物形态上较易识别，具三联小穗[1]。该属植物同时具有多年生植物和一年生植物。对于该属植物的利用，国内外没有太大区别。在一年生植物中，以粮食作物为主，如栽培种大麦、青稞。在多年生植物中，大多为优良牧草，如布顿大麦草(H. bogdanii)、短芒大麦草(H. brevisubulatum)和灰毛大麦草(H. murinum)等植物。大麦属植物除了可以作粮食和牧草以外，亦是耐盐碱植物，如小药大麦草(H. roshevitzii)、短芒大麦草和布顿大麦草等在盐碱草甸均有大量分布[19]。在实践中已有利用大麦来改良含盐量较高的盐碱林地的实例[20]。而常被用作牧草的大麦属植物，通过观察其生境，亦发现其具有耐盐特性。如国内被用作牧草的布顿大麦草和短芒大麦草均可在盐碱地生长，国外的地中海区域生长的禾草，H. hystrix和H. maritimum在沿海滩涂、盐碱化草甸或者沼泽中有大量分布[21]。除了考究其作为粮食作物和饲用植物的价值外，在面对盐碱化问题时，大麦属植物不仅可以作为耐盐碱植物直接应用于需要改良的盐碱地上，其基因资源亦是一种改良其他耐盐碱植物的宝贵资源。

2 大麦属内生真菌

2.1 大麦属内生真菌在宿主体内的分布

禾草内生真菌在宿主植物的茎髓、叶鞘和种子等地上部分的细胞间分布和生长，在生长过程中并不破坏细胞结构[22]。传统上，研究者大多利用能够使得内生真菌显色的生物染色剂(苯胺蓝、玫瑰红、龙胆紫等)处理植物组织，然后在显微镜下观察，从而辨别植物是否被内生真菌侵染[23-25]。随着科学的发展，酶联免疫、聚合酶链式反应和实时荧光PCR等分子技术也被应用于内生真菌的检测当中。

对于大麦属内生真菌在宿主体内的分布情况，国外尚无报道，国内仅赵晓静等[26]利用苯胺蓝染液对内生真菌在短芒大麦草植株内的分布进行了显微观察，发现内生真菌在短芒大麦草的种子(种皮、糊粉层和胚)、茎髓、叶鞘和叶片中均有分布，且形态和数量在不同部位存在差异。短芒大麦草的种皮、糊粉层和茎髓中菌丝分布相对密集，种皮中的菌丝呈线性不规则分布，糊粉层中的菌丝粗短，多围绕淀粉粒分布，茎髓中的菌丝细长，沿细胞伸长方向分布；叶片和叶鞘中菌丝分布相对较稀疏，菌丝分别沿叶脉和海绵组织细胞的延伸方向生长[26]。

2.2 大麦属内生真菌带菌率影响因子研究

早期关于内生真菌共生体的研究表明，倘若一种内生真菌可以增强宿主在自然界的竞争力，那么该内生真菌的侵染率就可能接近100%[27]。与驯化的禾草相比，在自然界中禾草的内生真菌侵染率通常变化比较大(0～100%)。内生真菌的侵染率的变化与宿主种类、生长年限、自然环境等外界因素有关[28-30]。然而具体是何种因素在禾草带菌率变化中起主导作用尚无定论。关于大麦属植物带菌率的研究国内外尚无具体深入的研究，仅仅是对降水量、海拔和土地利用方式对大麦属植物的带菌情况产生的影响做了简单的分析。

2.2.1 国外大麦属植物带菌率研究进展

国外对大麦属植物内生真菌资源的调查开展较早，涉及大麦属植物种类也较多，植物来源相对广泛。整体上大麦属植物带菌率在自然界中存在较大差异。这种差异既与环境有关系，也与植物及内生真菌的种类有关系。在20世纪90年代，Wilson等[31]对美国国家谷物保存中心(NSGC)保存的大麦属植物进行了内生真菌资源调查，结果表明，亚洲的布顿大麦草和短芒大麦草的带菌率在0～99%，南美的H. comosum 带菌率在0～92%(表1)。带菌率高的大麦属植物多生长在相对湿润的野外环境中，带菌率为0的植物则多生长在相对干旱的环境或者耕地和放牧地中[31]。在南美洲的巴塔哥尼亚草原上，Iannone等[32]却发现与内生真菌共生的H. comosum的带菌率在0～100%，其中，在干旱环境里带菌率较高。这个结果与对我国部分地区禾草带菌情况的调查结果有些出入，在纪燕玲等[33]和亢燕等[34]的调查中，虽然禾本科植物内生真菌偏爱阴凉的环境，但是内生真菌的检出率与当地的降水量没有相关关系。这一方面可能与植物种类或者内生真菌种类有关，另一方面也可能是两者在对环境的描述上有区别。亢燕等的调查没有记录共生体具体的生长环境，只是描述了采集地的大气候，而Wilsoon描述的是植株的具体生境[31]。在对黄山地区禾草内生真菌资源的调查中，不同海拔地区内生真菌的含量有着较大的差异[13]。Kivlin等[35]利用Meta-Analysis方法对前人的研究进行分析亦发现不同海拔，不同植物携带的内生微生物有明显差异，如在灌木中，内生真菌的数量随海拔升高而增多，而C3植物则随海拔升高而减少。

2.2.2 国内大麦属植物带菌率研究进展

国内南志标[36]最早发现新疆野生的布顿大麦草被内生真菌侵染，且布顿大麦草的带菌率高达81.5%。此后，Wei等[37]在对我国北方草地的禾草带菌情况的调查中，发现短芒大麦草内生真菌侵染率为4.76%。这两次调查并不是以大麦属植物为主要调查对象，而且均未考虑具体的环境因素对植物带菌情况的影响。2009年王正凤[38]对我国主要牧区的短芒大麦草样品进行内生真菌检测，结果发现，调查区的短芒大麦草带菌率在67%～100%，其中新疆、甘肃和内蒙古的短芒大麦草的带菌率均在70%以上。

除了以上提到的因素会对植物的带菌率产生影响以外，在羊茅属(Festuca)植物、黑麦草属(Lolium)以及芨芨草属(Achnatherum)植物上已经发现温度[39]、土壤盐分[40-41]、生长季节[42-43]和刈割次数[44]等因素均会对宿主体内内生真菌含量产生影响，而对于这些因素如何影响大麦属植物的带菌情况，目前国内外均无报道。相比根瘤菌以及菌根真菌，禾草内生真菌通过母系遗传具有较好的持久性，不用再次接种。而在自然界中，禾草的带菌率受各种因素的影响而出现或高或低的现象[30,45]，如果单纯因为宿主带菌率低而否定其携带的内生真菌，这难免会造成内生真菌资源的流失。研究影响内生真菌侵染率的条件可以帮助人们更好地了解内生真菌在自然界的存在规律，从而更合理地利用内生真菌来改善牧草乃至粮食作物的生产能力。

2.3 大麦属内生真菌鉴定

自20世纪70年代人们发现内生真菌与植物对家畜的的毒性有关以来，内生真菌得到了越来越多的关注。几十年来，人们对内生真菌的分类、分布、生理、生态、代谢和遗传等方面开展了大量的研究工作[46-48]。关于大麦属植物，国内外发现5种植物 (H. bogdanii、H. brevisubulatum、H. comosum、H. jubatum和H. roshevitizii)与内生真菌存在共生关系(表2)。国外目前已自带菌禾草分离鉴定得到8种内生真菌，其中3个为纯合菌，5个为杂交种；国内目前已发现3种大麦属禾草与内生真菌共生，但目前只发现和报道了1个种。

3 内生真菌对大麦属植物的影响

关于内生真菌对大麦属植物生长及抗逆性的影响的研究主要集中在国内。研究表明，内生真菌可以改善大麦属植物的生长及抗逆性。

3.1 促进种子萌发与幼苗生长

关于内生真菌对大麦属植物生长的影响，国内的研究表明，内生真菌的存在可以提高种子质量，有利于其萌发和保存，并且可以促进幼苗的生长。与未被内生真菌侵染的短芒大麦草相比，内生真菌侵染过的短芒大麦草，不仅种子的保存期限可以延长，而且在发芽以及后期营养生长方面也具有优势。赵晓静等[52]对带和不带内生真菌的短芒大麦草种子进行不同时间的人工老化处理，结果随着老化时间的增加，种子的各项发芽指标(发芽率、发芽势、芽长等)均成下降趋势。但是，在相同老化时间下，同不含有内生真菌的种子相比，带内生真菌的短芒大麦草种子具有更好的发芽指标。在相同的温室种植条件下，内生真菌可以增加布顿大麦草的生物量，与不带内生真菌的布顿大麦草相比，带内生真菌的布顿大麦草的分蘖数增加了136.8%，地上生物量增加了33.3%，根干重增加了30%[53]。在逆境条件下，内生真菌促进宿主萌发和生长的优势表现更为明显。在最适温度条件下，内生真菌的侵染并未给短芒大麦草带来发芽上的差异，但是在一定的低温或者高温胁迫，被内生真菌侵染的短芒大麦草种子具有萌发优势[54]。

3.2 提高抗逆性及其机理

大麦属内生真菌可以通过影响宿主体内的抗氧化酶活性、渗透物质的含量和增强植物对部分矿质元素的吸收能力等方式增强大麦属植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。目前，国内外关于大麦属植物内生真菌的抗逆性研究主要集中在耐盐、耐旱、耐涝、耐瘠薄、抗虫性和抗病性方面。国外主要集中研究了大麦属植物的抗虫特性，国内则对短芒大麦草的耐盐特性及其机理做了详细研究，另外对短芒大麦草内生真菌共生体对旱、涝、缺磷和病害等胁迫处理的响应，也作了一定量的研究。

3.2.1 提高耐盐性

纸上发芽试验表明，在NaCl 和相同渗透势的PEG的处理下，带菌短芒大麦草比不带菌植株具有更好的发芽表能力，这主要体现在带菌种子在盐胁迫下拥有更好的发芽率、发芽指数、胚根长和胚芽长[55]；在NaCl处理下的盆栽试验以及田间试验中，与不带菌植株相比，带菌短芒大麦草有着更高的生长速率、更多的分蘖数、更多的地上生物量和种子产量[38]。短芒大麦草在与内生真菌共生的情况下，面对盐胁迫可以保持较高生长速率的原因是内生真菌可以促使短芒大麦草的脯氨酸含量保持较高水平，而未与内生真菌共生的短芒大麦草的脯氨酸含量在胁迫后期出现下降。此外，内生真菌还可通过改善抗氧化酶活性的存在明显改善了短芒大麦草的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的活性，从而使得大麦草对盐胁迫有了更好的耐受能力[55-56]。内生真菌的存在不仅可通过调节植物酶活性来改善其生长状况，也影响植物对矿质元素的吸收，研究表明，内生真菌可以增强盐胁迫下短芒大麦草对氮、磷、钾的吸收，保证短芒大麦草在盐胁迫环境中对养分的吸收和运输，同时减轻钠离子的毒害[57-58]。

表 2 国际文献中已报道的大麦属Epichloë属内生真菌Table 2 Formally recognized Epichloë-grass association in the literature worldwide

3.2.2 提高耐旱和耐涝性

内生真菌可以改善大麦属植物在干旱、水分胁迫和低磷条件下的生长。随着外界渗透势的下降，短芒大麦草种子的各项发芽指标(发芽率、发芽指数和发芽势)以及幼苗含水量均成下降趋势。与未被内生真菌侵染的短芒大麦草相比，内生真菌侵染的短芒大麦草，有更高的发芽率、发芽势、发芽指数和含水量[54]。Song等[59]的研究表明，水淹胁迫条件下，当未被内生真菌感染的短芒大麦草出现萎蔫、根系活力下降的时候，被内生真菌侵染的植株却可产生更多的叶绿素进行光合作用，产生更多的分蘖、更高的地上部分，更多的地下生物量。这可能主要是因为内生真菌对维持植物的渗透势和氧化平衡具有积极作用。内生真菌侵染的植株可以产生更多的脯氨酸、更少的丙二醛以及较少的电解物质外渗来增强宿主植物细胞膜的稳定性和耐氧化能力。Iannone等[32]发现，分布于南美洲巴塔哥尼亚草原的长毛大麦(H. comosum)的带菌率在0～100%，其中，在干旱环境里带菌率较高。这说明在干旱环境中，长毛大麦可能更容易与内生真菌形成共生体。此外，关于营养胁迫亦有少量研究，方爱国[60]发现，在低磷条件下，内生真菌可以提高短芒大麦草的株高、分蘖数，表明内生真菌有改善短芒大麦草适应低磷环境的能力，但是对于具体的生理机制，国内尚无相关报道。

3.2.3 改善抗虫性

目前的主要研究结果认为，禾草内生真菌共生体对家畜、害虫以及节肢动物之所以能产生抗性，是因为内生真菌产生的生物碱对其有毒。目前已发现的生物碱主要包括麦角碱、吲哚双萜、吡咯并吡嗪和饱和吡咯化合物四大类，其中前两类对家畜有极强的毒性，对昆虫只有轻微的毒性，后两类对昆虫有极强毒性，对哺乳动物无毒或者有轻微毒性[61-62]。

醉马草(Achnatherum inebrians)、黑麦草和高羊茅，这3种植物会对家畜产生具有毒害作用的生物碱 (Ergonovine、Ergine、Ergovaline 和 Lolitrem B)[63]，然而对布顿大麦草(PI 314696、PI 440413和PI 269406)和短芒大麦草(PI 440420)的研究表明发现，内生真菌侵染的大麦属植物中，对家畜有毒生物碱的产碱规律不尽相同，如PI 314696和PI 440420含有Loline-(N-Formylloline)和 ergot(ergovaline)，而 PI 440413 和PI 269406则不含这两种生物碱[64]。而且在长时间的放牧利用过程中，并未发现家畜中毒事件，表明大麦属植物中的内生真菌具有培育对家畜无毒内生真菌菌株的潜力[64]。2019年Chen等[50]对短芒大麦草的产碱基因和生物碱种类进行了检测，只发现了可以产生Peramne和Chanoclavine I的基因，而且在生物碱检测中也只检测到了对昆虫有毒害作用的Peramine，这进一步证明了通过大麦属植物的内生真菌选育无毒菌株的可行性。

昆虫饲喂试验结果表明，对布顿大麦草(PI 314696、PI 440413和PI 269406)、短芒大麦草(PI 440420)的带菌植株与未带菌植株接入俄罗斯小麦蚜虫(Diuraphis noxia)、禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)、Metopolophium dirhodeum和小麦瘿蚊(Mayetiola destructor)，被内生真菌感染的PI 314696和PI 440420与未被内生真菌感染的同种植株相比对小麦蚜虫有显著的抑制作用；PI 314696、PI 440413、PI 269406和PI 440420对小麦瘿蚊有抗性效果；PI 440420对M. dirhodum有显著抑制作用，而R. padi的数量在这4种带菌植株上均无下降现象[65]。目前对于带菌植株对害虫不同的抗性表现，有的认为是因为生物碱含量不同，也有认为其表现受到宿主或者内生真菌基因型、种类以及害虫种类的影响[66-67]。此外，考虑到共生体生物碱含量以及种类的不同，大麦属植物内生真菌共生体对害虫的不同表现也可能是因为存在其他种类的生物碱尚未被发现。2017年的研究表明，禾草内生真菌共生体对昆虫的抗性不仅取决于生物碱，内生真菌也可以调节植物激素途径来调节植物对昆虫的防御能力[13]。大麦属植物是否存在其他种类的生物碱或者存在其他途径调节植物对昆虫的抗性尚需进一步研究。

3.2.4 增强抗病性

关于大麦属内生真菌的抗病性影响研究，目前仅在短芒大麦草上有报道，研究表明，无论是在离体还是活体条件下，内生真菌的存在均可增强宿主对病原真菌的抗性。杨松利用短芒大麦草草粉浸提液制得培养基培养病原真菌，发现其可显著抑制绿色木霉(Trichoderma viride)菌落的生长及孢子萌发[68]。孙一丹[69]对带菌与不带菌的短芒大麦草叶片及植株接入细交链孢(Alternaria alternata)、根腐离蠕孢(Bipolaris sorokiniana)、麦角菌(Claviceps purpurea)、新月弯孢(Curvularia launata)、德氏霉(Drechslera erythrospila)、燕麦镰孢(Fusarium avenaceum)、半裸镰孢(F. semitectum)和腐皮镰孢(F. solani)8种病原真菌。结果表明，与未被内生真菌侵染的离体叶片相比，内生真菌侵染的短芒大麦草叶片显著降低德氏霉、根腐离蠕孢、燕麦镰孢、半裸镰孢、新月弯孢、细交链孢和腐皮镰孢在叶片上的病斑数量以及病斑长度，但是抑制效果在不同种病原真菌间有明显差异。而通过在活体植株上接入病原菌发现，内生真菌可以通过调节短芒大麦草植株的生理物质的活性来增强对病原菌的抵抗能力，从而获得更多的地上和地下生物量[69]。

3.3 大麦属内生真菌的利用现状

虽然大麦属内生真菌具有上述优良性状，但与其他禾草内生真菌相比，在利用方面存在很大不足。关于禾草内生真菌的利用，国外开始的较早。目前在新西兰、美国和澳大利亚已有多种羊茅属和黑麦草属带菌品种在飞机场草坪和放牧地中使用，这些品种相比未带菌品种有着更好的抗病性和耐旱性[70]。然而，在大麦属植物上，国内外尚无选育带菌品种的报道，目前仅有兰州大学草地农业科技学院草地保护研究所正在选育耐盐碱的野大麦内生真菌品种，已将收集的野生材料区分为带菌与不带菌种群，并且人工种植于草地农业生态系统国家重点实验室临泽试验站7年有余，期间，分别对其生育期和农艺性状进行了一定的统计，与不带菌品种相比，带菌品种在产量和耐盐性上均具有一定优势。

4 问题及展望

自Wison(1991年)最早发现大麦属内生真菌[71]，近30年的时间里，人们对大麦属内生真菌共生体在内生真菌鉴定和抗逆性方面虽然取得了一些成果，但是仍旧存在一些问题：

1)影响大麦属植物内生真菌带菌率的因素不清楚。从国内外对于内生真菌共生体的研究中可以发现，禾草带菌率受到温度、降水量、土地利用方式、海拔、生长季节以及植物自身年龄的影响。诸多因素的作用，导致禾草的带菌率在自然界中变异极大。了解影响植物带菌率高低的因素，可以帮助人们对禾草带菌率有一个正确的认识，在选育带菌率高的禾草品种过程中，做出正确的判断。

2)影响生物碱含量的因素不清楚。禾草中存在的生物碱对于植物的抵御生物胁迫的能力起着至关重要的作用。研究表明，醉马草[72-73]和黑麦草[42]的生物碱含量的多少受温度、pH和植物年龄的影响。在与内生真菌共生的大麦属植物中，已发现多种生物碱，但是影响其含量变化的因素尚不清楚，而控制牧草体内生物碱含量对于大麦属植物作为牧草利用至关重要。

3)对大麦属内生真菌共生体的利用不充分。国外对黑麦草和高羊茅内生真菌共生体的研究开展较早，应用研究也较充分，目前黑麦草和高羊茅的内生真菌共生体育种在美国、新西兰和澳大利亚得到广泛的应用[70]。选育的优良菌株(如Epichloë coenophiala、Epichloë festucae var. lolii)和带菌品种(Argona、Antti、Wranger等)已经创造出巨大的经济价值[46]。而对于大麦属内生真菌共生体的利用在国内外均无报道。

对于大麦属内生真菌共生体的抗逆性研究表明，内生真菌的存在可以在不同程度上改善大麦属植物对于盐碱胁迫、干旱胁迫、水涝胁迫以及病害和虫害的抵抗能力。选育带内生真菌的大麦属牧草或者草坪新品种，不仅对于缓解西北水资源匮乏问题和开发利用盐碱地解决耕地不足问题具有重要的意义，而且培育抗虫抗病品种，减少化学药剂的使用，也符合当下绿色环保农业的潮流。对于大麦属的内生真菌的利用可以不单单局限于大麦属植物，也可以将其人工接种到谷物作物中，充分发挥其价值。2018年，Wang和Li[74]已经在温室试验中成功的将野大麦的内生真菌接入粮食作物大麦中，成功接菌的大麦比未接菌的大麦有更高的株高，更多的分蘖。在无毒内生真菌菌株选育方面国内外均无报道，这在一定程度上对于大麦属植物内生真菌资源的利用带来了不便，应当进行更加深入的研究，对大麦属植物携带的内生真菌进行筛选鉴定，根据不同的利用方式选择培育不同优点的内生真菌菌株。