发酵前后不同分子量段全蝎白术混合品体外抗肿瘤研究

毛会秀 陈美琦 刘金虎 吕迎兰 方园 张瑞 王集会

摘要：目的  研究全蝎白术混合发酵品的抗肿瘤活性，确定药物抗肿瘤的活性部位。方法  依据双指标优化提取工艺的最优条件对全蝎白术混合发酵品进行超声提取。采用超滤手段，分别用截留量为5 kD和10 kD的超滤膜对水提液进行超滤分段，测定各分子量段中蛋白质和多糖的含量，采用MTT法检测体外抗肿瘤活性，并以未发酵品做对照。结果  各分子量段对2种肿瘤细胞抑制效果具有差异性，醇沉上清液对肿瘤细胞的抑制效果最好，其次为分子量段>10 kD全蝎白术混合发酵品，且全蝎白术混合发酵品对肿瘤细胞抑制作用显著优于未发酵品。结论  全蝎白术混合发酵品对乳腺癌细胞、喉癌细胞均有较高的抑制作用，其活性部位主要为醇沉上清液和分子量段>10 kD全蝎白术混合发酵品。

关键词：全蝎白术混合发酵品;超滤分段;抗肿瘤

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）07-0040-04

Abstract： Objective To study the antitumor activity of Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product; To determine the antitumor active sites of Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product. Methods Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product was extracted by ultrasonic assay on the basis of the optimal conditions of the double index optimization extraction process. The water extract was segmented by ultrafiltration membrane with a retention of 5 kD and 10 kD respectively. The contents of protein and polysaccharide in each molecular weight segment were determined. MTT assay was used to study the antitumor activity in vitro. The unfermented product was used as the control group. Results The inhibitory effects of different molecular weight segment on the two tumor cells were different， and the inhibitory effects of alcohol supernatant on the tumor cells were the best， followed by the SAHFP of molecular weight >10 kD segment. Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product was significantly better than that of unfermented products. Conclusion Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product has a high inhibitory effect on breast cancer cells and laryngeal cancer cells. The active sites of antitumor drugs are mainly the alcohol supernatant and the Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product of molecular weight >10 kD segment.

Keywords： Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation; ultrafiltration segment; antitumor

全蝎為钳蝎科动物东亚钳蝎Buthus martensii Karsch的干燥体[1]143，主要活性成分为蝎毒，其毒性强烈，若服用不当，会出现一系列不良反应。因此，临床使用时需进行合理的药物配伍，进而降低全蝎的毒性，最大程度发挥其药效。《医宗金鉴》认为可用全蝎、僵蚕为醒脾汤化痰治标，更用人参、茯苓、白术温补中气，恢复脾气健运，助化痰祛邪，使邪去而不伤正。白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，具有健脾益气、燥湿利水功效[1]103。王彦多等[2]将攻毒散结的全蝎与健脾益气的白术相配伍，发现球孢白僵菌发酵的全蝎白术混合发酵品（SAHFP）提取液具有显著的抗肿瘤作用。据此，本实验对有效部位进行探讨，以期通过超滤分段分离SAHFP中有效成分，进一步明确抗肿瘤活性部位，为该药物成分及其他中药配伍研究提供参考。

1  实验材料

1.1  药材和菌种

全蝎，购自山东临沂沂水;白术，购自河北安国药材市场，经山东中医药大学高德民副教授鉴定分别为钳蝎科动物东亚钳蝎的干燥体和菊科植物白术的干燥根茎。菌种为山东省农业科学院植物保护研究所自筛菌株[桃5（球孢白僵菌）Beauveria bassiana（Bals.）Vuill]。

1.2  主要试剂与仪器

1640细胞培养基（Hylcone-赛默飞世尔生物制品北京有限公司），牛血清蛋白，胰酶细胞消化液;Folin-酚试剂（国药集团化学试剂有限公司），无水乙醇、苯酚、浓硫酸、酒石酸钾钠等均为分析纯。KQ-500GVDV型双频恒温数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），WT600-2J型超滤仪（上海摩速科学器材有限公司），DNM-9602酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司），LGJ-18A型冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）。

1.3  细胞株

乳腺癌MCF-7细胞株和喉癌Hep-2细胞株，均由山东省立医院提供。

2  实验方法

2.1  全蝎白术混合发酵品制备

白僵菌菌种制备：用接种针取桃5（球孢白僵菌）活化菌种适量，无菌接种至PDA培养基，培养7 d，将第2代菌种用蒸馏水稀释成含有1×108个孢子/mL白僵菌孢子的混悬液备用。

SAHFP制备：全蝎粉、白术粉按1∶1比例混合，加白僵菌孢子混悬液适量润湿，搅拌均匀，温度25 ℃、湿度95%以上环境，自然光照，发酵7 d，长满菌丝后停止发酵，取出冷冻干燥，得冻干粉备用。

2.2  全蝎白术混合发酵品水提液制备

精密称取1.000 0 g SAHFP置于100 mL具塞锥形瓶，按双指标优化工艺中最优提取条件进行提取[3]，重复提取2次，离心、抽滤，得滤液备用，未发酵的全蝎白术混合品同法处理作为对照。

2.3  水提液醇沉

将“2.2”项下得到的滤液进行醇沉[3]，使成80%醇溶液，密封，置于4 ℃冰箱，静置过夜。将得到的醇溶液过滤，回收上清液中乙醇，并冷冻干燥，得上清液冻干粉。分离的沉淀物用一定比例蒸馏水溶解，过滤，除去不溶于水物质，再用8 μm滤膜进行抽滤，除去大分子硬颗粒物，得到待超滤液。未发酵混合品的超滤水提液同以上步骤。

2.4  待超滤液分段

在0.5～1.0 MPa压力范围内用蒸馏水冲洗10 kD和5 kD超滤膜各20 min，再对待超滤液进行超滤分段，循环多次，分别得到分子量段>10 kD、5～10 kD和<5 kD的溶液，将3组分子量段溶液进行冷冻干燥，得到不同分子量段冻干粉备用。

2.5  蛋白質和多糖含量测定

采用改良Lorry法测定蛋白质含量[4]，牛血清蛋白标准曲线回归方程为Y=0.002 4X+0.010 4，r=0.999 2。称取一定量“2.3”“2.4”项获得的冻干粉，加水溶解，于650 nm波长处测定不同分子量段的吸光度，根据回归方程计算不同分子量段蛋白质得率。

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，得到多糖标准曲线回归方程为Y=0.016 1X-0.002 4，r=0.999 7。称取一定量“2.3”“2.4”项获得的冻干粉，加水溶解，于490 nm波长处测定不同分子量段的吸光度，根据回归方程计算不同分子量段多糖得率。

2.6  体外抗肿瘤实验

2.6.1  溶液配制

称取不同分子量段冻干粉各10 mg，溶于5 mL 1640细胞培养基中，配成初始浓度为2 mg/mL的溶液，无菌条件下0.22 μm滤膜过滤，然后用1640细胞培养基逐步稀释，配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL浓度溶液。

2.6.2  MTT法检测

将处于对数生长期的乳腺癌MCF-7细胞、喉癌Hep-2细胞胰酶消化，加入1640细胞培养基稀释至细胞浓度为1×106/mL，以每孔100 μL接种到96孔培养板中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后，弃去上清液，每孔加入配好的药物溶液100 μL，每个浓度设5个复孔，阴性对照组加入不含血清的1640细胞培养基100 μL，阳性对照组加入100 μg/mL顺铂100 μL，放入培养箱中继续培养。24 h后，每孔避光加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，放入培养箱中反应4 h。吸去上清液，每孔加入100 μL DMSO，摇匀，于酶标仪492 nm处测定OD值，并计算不同分子量段对肿瘤（乳腺癌、喉癌）细胞的抑制率。

3  统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  发酵前后不同分子量段冻干粉蛋白质、多糖得率比较

SAHFP中蛋白质主要集中在醇沉上清液中，而多糖集中于分子量段>10 kD药液中，见表1。该分子量段药液中多糖并非全部来自白术，全蝎中也有部分多糖如酸性黏多糖等，并且在真菌生长过程中产生了许多次生代谢物质如聚酮类物质，主要为大分子物质。

4.2  不同分子量段冻干粉对乳腺癌MCF-7细胞抑制率的影响

0.3、0.4 mg/mL SAHFP和未发酵品对乳腺癌MCF-7细胞抑制率有显著差异，而0.5 mg/mL SAHFP和未发酵品对乳腺癌MCF-7细胞抑制率无明显差异;SAHFP和未发酵醇沉上清液对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率随浓度的升高而升高，但未发酵上清液抑制率均低于SAHFP的抑制率。见图1A。SAHFP和分子量段>10 kD未发酵品对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率有显著差异;分子量段>10 kD SAHFP对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率均高于分子量段>10 kD未发酵品，可明显看出在该分子量段发酵品对肿瘤的抑制效果高于未发酵品。见图1B。分子量段5～10 kD SAHFP和未发酵品对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率有显著差异，分子量段5～10 kD SAHFP和未发酵品无抑制肿瘤细胞生长的作用;分子量段5～10 kD未发酵品浓度达0.8 mg/mL和1.0 mg/mL时对肿瘤细胞有抑制作用，但抑制率较低，均未超过10%。见图1C。

4.3  不同分子量段冻干粉对喉癌Hep-2细胞抑制率的影响

SAHFP和未发酵品醇沉上清液对喉癌Hep-2细胞抑制率有显著差异;在一定浓度下，两者对肿瘤细胞均具有抑制作用，且SAHFP的抑制效果更显著。见图2A。分子量段>10 kD SAHFP和未发酵品对喉癌Hep-2细胞抑制率有显著差异，SAHFP对肿瘤细胞抑制效果远高于未发酵品，且SAHFP对肿瘤细胞抑制率随浓度的升高而升高。见图2B。分子量段5～10 kD SAHFP和未发酵品对喉癌Hep-2细胞生长有促进作用，二者差异显著;但对肿瘤细胞均无抑制效果。见图2C。

5  讨论

由表1可知，通过微生物发酵技术，SAHFP与未发酵品比较，总蛋白质含量减少，多糖含量增加;通过超滤后各分子量段蛋白质含量研究发现，SAHFP中蛋白质主要集中在醇沉上清液中，而未发酵混合品醇沉上清液中蛋白质含量较少，说明在微生物发酵过程中，大分子蛋白被酶解为小分子蛋白和肽类，因为一般通过80%乙醇沉淀，小分子肽类能溶于其中，而大分子蛋白质则因为水化层破坏而沉淀析出。对多糖而言，分子量段>10 kD药液中多糖含量明显高于醇沉上清液中多糖含量，且SAHFP多糖含量比未發酵品高，说明白僵菌中其他物质（氨基酸、脂肪酸等）通过特定的途径（糖异生等）合成大量的多糖类物质。

通过对2组肿瘤细胞抑制率分析发现，SAHFP对肿瘤细胞的抑制效果均高于未发酵品，且醇沉上清液的抑制效果最为明显;分子量段>10 kD SAHFP，对肿瘤细胞抑制率随浓度的升高而逐渐升高，而未发酵品则表现出相反的作用效果，对肿瘤细胞的生长具有一定的促进作用。总之，通过微生物发酵，可显著增强体外抗肿瘤细胞株的作用。

蝎毒作为全蝎药理作用的主要有效成分，分子量在6000～9000 D，但也有3000 D或大于10 000 D，同时蝎毒具有蛋白质的通性，易被乙醇溶液沉淀，沉淀物可再复溶于水[5]。多糖也属于生物大分子，可通过乙醇沉淀析出。侯轩等[6]通过凝胶渗透色谱法测定白术多糖的分子量为4360 D，同时白术多糖可促进人胃癌细胞的凋亡[7]。本实验选择80%醇溶液进行醇沉，得到的沉淀物以多糖和蛋白质为主，超滤膜选择截流量为5 kD和10 kD两种，对SAHFP和未发酵品进行双重超滤分段，从而对抗肿瘤的活性部位进行了可靠的判定。

中药提取液进行醇沉，不仅可除去一些杂质，还使一部分有效成分流失，故一定要缓慢加入乙醇，快速搅动药液，避免局部醇浓度过大，造成有效成分的损失;醇沉后的上清液不能随意舍弃，应一并进行体外抗肿瘤实验比较。

综上，本实验研究表明，醇沉上清液中小分子物质对乳腺癌MCF-7细胞、喉癌Hep-2细胞均具有显著的抑制效果，该物质没有因发酵而被破坏，而且通过发酵，SAHFP对肿瘤细胞抑制作用显著增强，尤其是分子量段>10 kD的物质发酵后抑制效果远远高于未发酵品，说明发酵过程会增强全蝎、白术两者对肿瘤细胞的抑制作用。本研究主要观察全蝎白术配伍增加抗肿瘤的效果，未涉及全蝎白术配伍减轻毒性的研究，这是今后深入研究的重点。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2] 王彦多，刘颖，桑晓，等.双指标优化全蝎白术混合发酵品水提工艺及抗肿瘤试验研究[J].中南药学，2018，16（7）：978-981.

[3] 孙玉琦，刘晓娟，代春美，等.中药醇沉技术应用与评价[J].中成药， 2010，32（11）：1961-1963.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：三部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：440-441.

[5] 罗跃，彭延古，易小明.全蝎的化学成分及其作用的研究进展[J].湖南中医药大学学报，2008，28（3）：78-80.

[6] 侯轩，周家容，田允波.白术多糖的提取、分离纯化及分子量的测定[J].仲恺农业工程学院学报，2009，22（2）：18-21，30.

[7] 王鹤，陈拥军，张中华.白术多糖对胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响[J].中国民族民间医药，2015，24（24）：10-11.

（收稿日期：2018-12-14）