Pyk2磷酸化介导糖皮质激素反馈

邓 琼， 朱婉蓉， 王 铸， 张建文， 梁 辉

(深圳市龙华区人民医院，广东 深圳 518109)

大脑皮层接收外界刺激后，刺激下丘脑分泌促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)进入垂体门静脉循环，与垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)细胞内的受体(CRHR)结合，促进细胞合成和分泌ACTH。ACTH可以刺激肾上腺皮质释放糖皮质激素。当糖皮质激素浓度升高至一定水平时，可以反馈作用于下丘脑和垂体，分别抑制CRH和ACTH的分泌，最后抑制糖皮质激素的分泌。因此，糖皮质激素的分泌就呈脉冲式分泌，约一小时一个周期，亦称为超日节律[1]。

有研究提出，糖皮质激素抑制垂体ACTH的分泌介导糖皮质激素分泌超日节律的形成，垂体是调控糖皮质激素分泌的中枢[2]。在我们的前期研究中，我们建立了大鼠垂体细胞灌注系统，持续灌注CRH和血管升压素，细胞的ACTH分泌亦呈脉冲式[3]。同时，应用大鼠垂体细胞灌注系统，我们研究发现，生理水平的糖皮质激素(10nM)可快速抑制垂体ACTH的分泌，不受转录抑制剂或蛋白翻译抑制剂阻断，且该抑制作用由糖皮质激素受体(GR)介导[4]。

有研究报道Pyk2(Proline-rich tyrosine kinase 2)磷酸化信号通路可能介导糖皮质激素在下丘脑神经元的快速反应[5]。Pyk2，属粘着斑激酶家族，广泛分布于多种组织和细胞。Yang等发现皮质酮能激活酪氨酸激酶Pyk2，刺激10min后显著提高402位点的磷酸化水平，并持续升高达60min或更长[5]。抗磷酸化Pyk2 Tyr-402的免疫染色也佐证了此实验结果。Pyk2磷酸化能进一步激活位于其信号通路下游的蛋白激酶Src，Src激酶与GR形成稳定的蛋白复合体。有研究发现地塞米松能快速诱导Pyk2 Tyr-402的磷酸化[6,7]，在10min时达最高水平，而30min时降低至正常水平[6]。然而，Giles等人发现与对照组相比，地塞米松处理的巨噬细胞的Pyk2磷酸化水平要更低一些[8]。糖皮质激素激活Pyk2的具体机制仍有待进一步研究。

在本研究中，我们设计实验，应用大鼠垂体细胞灌注系统，研究Pyk2磷酸化是否通过GR，参与介导糖皮质激素反馈。该研究将进一步阐明糖皮质激素作用的分子机制，丰富糖皮质激素生理作用的内涵，为临床皮质醇增多症的诊治提供参考依据。

1 材料方法

1.1 实验动物及试剂

雄性SD(Sprague Dawley)大鼠购自广东省医学实验动物中心(中国佛山),ACTH浓度测定试剂盒来源于R&D systems(USA),细胞培养的试剂购自Gibco(Life Technologies，USA)，垂体细胞的原代分离试剂来源于Sigma Aldrich(USA),小鼠垂体瘤细胞系AtT20细胞购自ATCC(CRL-1795)。

1.2 垂体细胞的分离培养及灌注

大鼠体重225-250g，自由采食，到达后16h白天/8h黑夜的条件下稳定饲养5天以上。CO2麻醉昏迷，断颈处死。取垂体前叶组织，PBS清洗两次，剪成1mm3的小块，胰蛋白酶37℃消化15min，加DNaseI沉降组织，胰蛋白酶抑制剂终止消化，以2mM和1mM EDTA溶液洗涤两次，将组织转移至15ml的离心管内，轻轻反复吹打，吸取云状上清到细胞筛过滤，反复重复此步骤。200g离心15min收集细胞，重悬后计数。将细胞稀释至1.5×106个/ml，加Cytodex珠子(GE Healthcare)。细胞培养箱中培养，每30min轻微摇匀混合，待大部分细胞粘附珠子后，加入10%马血清及双抗。37℃，5%CO2细胞培养箱中稳定培养48-72h。连接细胞灌注系统装置，将垂体细胞转移至细胞灌注系统中，37℃预热的培养液(无血清培养基，0.1%BSA)预跑排尽装置内空气。细胞在系统中平衡6h，在开始刺激前，收集30min的培养液作为基础水平参照，每5min收集的培养液作为一个样品。将培养液转换成含激素(CRH和皮质酮)的培养液，收集样品，记录添加的时间和对应的收集管号。实验结束后，清洗整个系统，灌入空气干燥。采用ACTH化学发光酶联免疫吸附测定试剂盒测定样品中ACTH的浓度。

1.3 蛋白免疫印迹

我们采用Pierce的培养细胞亚细胞蛋白分离试剂盒(Thermo Scientific，美国)，根据说明书提取蛋白后，测定蛋白浓度，按20μg蛋白/孔准备样品，98℃水浴5min。上样电泳，120V，1h 45min。转膜，恒电流330mA 90min。5%TBST牛奶室温封闭1h。一抗4℃孵育过夜；所用的抗体及其稀释倍数见表1。次日TBST洗涤3次，每次5min；加入对应二抗常温孵育1h。TBST洗涤3次，每次10min。用Millipore化学发光液发光，Tanon-5520自动曝光仪器化学曝光。

表1 实验所用抗体

1.4 数据统计分析

数据以多个重复实验的平均值±标准误差表示，不同组之间的数据差异性检验是通过独立样本t检验或者One/Two-way ANOVA分析，后以Fisher配对检验。显著性差异P<0.05。

2 结 果

2.1 皮质酮和CRH对Pyk2磷酸化的作用

我们培养小鼠垂体瘤细胞系AtT20细胞，并对细胞进行皮质酮和CRH刺激。我们之前的数据表明，30pM的CRH能促使垂体细胞稳定地分泌ACTH，且10nM的皮质酮可以显著抑制ACTH的分泌[3]。蛋白免疫印迹结果显示，30pM的CRH刺激AtT20细胞，10min后Pyk2(Tyr402)磷酸化水平显著上升(1.82±0.06倍，P<0.01)，随后慢慢回落；同样，单独使用皮质酮刺细胞10min，Pyk2磷酸化水平升高1.58±0.10倍(P<0.05)，随后回复接近正常水平。同时采用CRH和皮质酮处理细胞时，10min后Pyk2磷酸化水平略有下降(P>0.05)，20min后开始持续上升(2.33±0.35倍，P<0.01)。

2.2 Pyk2抑制剂PF对GR转运的影响

我们检测Pyk2抑制剂PF对GR转运的作用。经查阅资料和前期预实验结果表明，3μM的PF能显著抑制Pyk2磷酸化。细胞密度达70%-80%时,激素剥离血清过夜,次日无血清培养4h,加PF继续培养2h,随后以皮质酮刺激。蛋白免疫印迹(图2A)和数据统计(图2B)结果显示，PF能显著抑制GR向细胞核转运，但不影响GR向细胞膜的转运。

2.3 Pyk2抑制剂对糖皮质激素快速反馈的影响

垂体细胞在灌注系统中平衡6h，收取6个样本(30min)作为基础对照组；接着以30pM CRH刺激细胞1h，在处理组加入PF，10min后两组均加入皮质酮；皮质酮刺激30min后撤掉PF和皮质酮，换30pM CRH继续灌注1h。3次重复的实验结果均显示，PF不阻止皮质酮对CRH刺激ACTH分泌的快速抑制作用，PF引起了滞后的长时间的ACTH分泌的抑制(50-60min)。

A.蛋白质免疫印迹检测结果；B.3个重复实验的统计分析结果

图1 皮质酮和CRH对Pyk2磷酸化的作用

Fig.1 Effect of corticosterone and CRH on Pyk2 phosphorylation

A.Dection of western blot;

B.Statistical data from three repeated experiments

A.蛋白质免疫印迹检测结果；B.3个重复实验的统计分析结果

图2 PF对GR转运的影响

Fig.2 Effect of PF on GR trafficking

A.Dection of western blot;

B.Statistical data from three repeated experiments(**:p<0.01)

图3 PF对皮质酮抑制ACTH分泌的作用Fig.3 Effect of PF on corticosterone-inhibited ACTH secretion

3 讨 论

糖皮质激素是一类由肾上腺皮质分泌、具有广泛生理作用的类固醇激素，可调节机体的物质代谢、水盐代谢并影响器官系统的功能,增强机体在应激反应中的抵抗力,同时还具有抗炎、抗休克和免疫抑制作用。糖皮质激素主要通过经典途径(基因组作用)和非经典途径(非基因组作用)发挥生物学效应，其中，非基因组作用在机体生理和病理过程中具有重要的生物学意义，但是其分子机制尚不明了[9]。

Pyk2，属粘着斑激酶家族，广泛分布于多种组织和细胞[10]。Pyk2活化同时可以进一步引起MAPK-Erk1/2信号转导[11]，还可以通过GSK3β-Wnt/β-catenin信号通过调控肿瘤的发生发展[12,13]。Pyk2作为一种活跃的非受体酪氨酸蛋白激酶，通过多种信号转导方式及信号通路，参与多种生理活动，实现其生物学效应[10,14]。Pyk2磷酸化能进一步激活位于其信号通路下游的蛋白激酶Src[15]；Src激酶与GR形成稳定的蛋白复合体，且糖皮质激素可刺激激活Src磷酸化[5,16]。有研究指出Pyk2的活化可以不需要受体或其他激酶的参与即可完成[10]，这与快速非基因组作用的方式一致。鉴于此，我们设计实验，研究Pyk2磷酸化是否介导糖皮质激素快速反馈。

蛋白免疫印迹结果显示，单独采用CRH，或者皮质酮刺激细胞，可引起Pyk2位点402的快速磷酸化(10min)，这一反应与皮质酮快速抑制ACTH的分泌一致[4]。持续刺激时，磷酸化水平慢慢回落，接近正常生理水平。当同时添加CRH和皮质酮刺激时，Pyk2的磷酸化出现短期抑制趋势，随后快速升高(20min)。

我们的前期研究结果表明，GR介导了糖皮质激素的快速抑制作用[4]。我们应用了Pyk2抑制剂PF，研究PF对细胞内GR转运的作用。蛋白免疫印迹结果显示，PF不影响GR的细胞膜转运，表明抑制Pyk2并不影响糖皮质激素的快速非基因组作用；PF阻止了受体向细胞核的转运，表明Pyk2可能通过调控靶基因的转录激活或抑制，参与糖皮质激素的基因组作用。

我们进一步采用了垂体细胞灌注系统进行了验证，结果与蛋白免疫印迹结果一致。PF不影响糖皮质激素激素对ACTH的快速抑制作用，却引起了ACTH分泌延后的长期抑制，延后时间为50～60分钟，与基因转录的最快时间大致相当。因此，综合这些实验结果，我们可以得出，Pyk2可能通过抑制GR向细胞核转运，参与调控糖皮质激素的作用。但是，单独皮质酮或CRH刺激引起的Pyk2的快速磷酸化的机制，以及可能参与的作用，仍然需要进一步深入的研究和探讨。