自噬相关蛋白LC3和E-钙黏蛋白、波形蛋白在子宫内膜异位症中的表达

代小燕，邸石，靖芳

作者单位：武汉市第三医院妇产科，湖北 武汉 430061

子宫内膜异位症（内异症）是不孕症和慢性盆腔疼痛的常见原因，其特征是子宫内膜腺体和间质的子宫腔外生长，近年来发病率呈明显上升趋势。内异症虽是良性疾病，但具有类似恶性肿瘤广泛种植及侵袭生长能力的生物学行为。黏附-侵袭-血管生成是子宫内膜异位症异位种植发生病变的基本病理生理过程［1］。已有研究表明，自噬广泛参与肿瘤的侵袭转移过程，并对上皮间质转化（EMT）的发生进行调控［2］。本研究旨在探讨自噬相关蛋白LC3以及和EMT相关的E-钙黏附蛋白（E-cadherin），波形蛋白（Vimentin）在子宫内膜异位症病人异位及在位子宫内膜组织中的表达情况，探讨其与子宫内膜异位症发生、发展的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2018年1—11月在武汉市第三医院妇科行腹腔镜或开腹手术治疗的41例卵巢子宫内膜异位症合并有子宫腺肌病，因病变广泛、痛经症状进行性重，保守治疗无效且无生育要求而行全子宫切除术病人，术中留取在位子宫内膜及异位子宫内膜，分为在位内膜组和异位内膜组，平均年龄（39±3.5）岁；选取同期38例因子宫肌瘤行全子宫切除术病人为对照组，术中留取正常子宫内膜，为正常内膜组，平均年龄（41±2.3）岁。各组病人在年龄上差异无统计学意义（P＞0.05）。选取病人均有规律的月经周期，术前至少6个月未服用任何激素类药物，无其他内分泌及内外科合并症。在增殖期收集子宫内膜标本，临床诊断均以术后病理结果为准。该实验在标本采集前均告知并签署知情同意书，本研究的伦理批准来自湖北省武汉市第三医院伦理委员会（武三医伦KY2018-013）。

1.2子宫内膜组织中LC3B、E-cadherin和Vimentin表达检测将新鲜手术标本在10%甲醛中固定24 h，然后包埋在石蜡块中。将甲醛固定和石蜡包埋的子宫内膜组织切成5 μm，并安装在经乙醇清洁的载玻片上。经过脱蜡、脱苯、水化后采用SP法检测LC3、E-cadherin和Vimentin表达，SP免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司，步骤参照试剂盒说明书。每张切片随机取20个高倍镜（×200）视野，每个视野计数100个细胞，统计阳性细胞数，无细胞着色为（-），阳性细胞数百分比＜25%（+）、26%～50%（++）、51%～75%（+++）、＞76%（++++），+～++++均记为阳性表达，计算阳性表达率。分析子宫内膜组织中LC3、E-cadherin和Vimentin表达的相关性。

1.3统计学方法采用SPSS 20.0统计软件。计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman秩相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 子宫内膜异位症41例和子宫肌瘤38例代表性的染色实例（免疫组织化学染色）

2 结果

运用免疫组织化学染色检测LC3、E-cadherin和Vimentin的表达，代表性的染色实例见图1。LC3定位在腺上皮细胞和基质细胞的细胞质内；E-cadherin定位于两种细胞的细胞膜和细胞质；Vimentin定位于基质细胞的细胞质。异位子宫内膜组中LC3的阳性表达率显着高于正常子宫内膜组和在位子宫内膜组（P＜0.05），LC3的阳性表达率在正常子宫内膜组和在位子宫内膜组中差异无统计学意义（P＞0.05）；异位子宫内膜组和在位子宫内膜组中E-cadherin阳性表达率均低于正常内膜组（P＜0.05）；异位子宫内膜组和在位子宫内膜组中Vimentin阳性表达率均高于正常内膜组（P＜0.05）。异位内膜组中自噬相关蛋白LC3与E-cadherin表达呈负相关（r＝-0.627，P＜0.05），LC3 和 Vimentin（r＝0.537，P＜0.05）表达呈正相关，E-cadherin与 Vimentin（r＝-0.615，P＜0.05）表达呈负相关。各组LC3、E-cadherin和Vimentin阳性表达率比较见表1。

表1 子宫内膜异位症41例和子宫肌瘤38例各组LC3B、E-cadherin和Vimentin表达比较/例（%）

3 讨论

子宫内膜异位症是育龄女性的常见病及难治病，严重影响女性健康和生活质量。Sampson的经血逆流学说是内异症经典理论，但不能解释90%的经血逆流发生率，而只有10%～15%女性发生内异症的现象。子宫腔外子宫内膜组织的迁移，侵袭和血管生成是子宫内膜异位症进展的关键步骤［3］。子宫内膜异位症是一种多因素疾病，其发病机制一直是妇科基础与临床研究的热点，迄今为止，内异症发病机制仍不明确。

自噬是一种高度保守的细胞行为，是细胞应对营养缺乏、缺氧、感染等恶劣环境因素的生存机制之一，其可通过降解胞质内受损细胞器，产生氨基酸与游离脂肪酸以供蛋白质和能量的合成，其通过维持肿瘤细胞在代谢应激环境下存活来促进转移进程［4］。已有有研究表明，自噬广泛参与肿瘤的侵袭转移过程，并对EMT的发生进行调控［5］。自噬能够激活EMT促进肝癌细胞的侵袭：TGF-β1作为EMT发生最重要的诱导因子，能够激活自噬；而自噬激活可使肝癌细胞的TGF-β1表达水平显著上升，进一步使肝癌发生EMT与获得侵袭转移表型，从而形成正反馈的循环效应［6］。已知LC3（酵母Atg8的哺乳动物同源物）存在于自噬体上，并且LC3 I-II的转化是监测该过程的广泛使用的标志物［7］，因此LC3的表达强度与自噬活性密切相关。近年来，科学家们发现自噬与子宫内膜异位症的发生、发展存在密切联系，有研究表明，自噬在卵巢子宫内膜异位症中被上调，并且可能有助于子宫内膜异位细胞的存活和异位部位的病变维持［8］。然而，关于子宫内膜异位症中自噬的表达水平存在争议性结果，Choi及其同事报道，异位内膜中的自噬水平降低，同时p70S6K磷酸化的激活（mTOR激活的特征）［9］。

EMT是指在某些特殊的生理或病理条件下，上皮细胞在形态学上发生向间质细胞表型的转变并获得迁移能力的过程［10］。上皮细胞标志物如ECadherin表达下调或缺失是EMT的最重要的标志性变化，也是上皮肿瘤细胞侵袭的前提条件［11］。间质表型标志物Vimentin是间质细胞中最主要的中间纤维，其表达升高是导致E-Cadherin表达缺失的原因之一，同时会干扰E-Cadherin介导的细胞黏附作用。基于EMT的发生发展与内异症异位种植和转移的生物学特征相契合，近年来EMT与内异症发病的关系引起学者们的广泛关注［12］。EMT失衡可能是导致子宫内膜异位性疾病发生的机制之一，有研究证实在异位内膜中EMT的发生在促进内异症异位子宫内膜细胞的侵袭和转移中扮演重要角色［13］。

本研究通过免疫组化SP法检测LC3和EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin在正常子宫内膜、在位子宫内膜及异位子宫内膜中的表达情况，并做相关性分析。本研究结果显示，以正常子宫内膜作为对照，子宫内膜异位症病人异位子宫内膜组中LC3的阳性表达率显着高于正常子宫内膜组和子宫内膜异位症病人在位子宫内膜组（P＜0.05），且异位内膜组中E-cadherin表达阳性率明显低于正常子宫内膜中E-cadherin表达阳性率（P＜0.05），异位内膜上皮细胞中Vimentin的表达阳性率明显高于正常内膜上皮细胞中Vimentin的表达阳性率（P＜0.05），在异位内膜组中，三者表达具有相关性。总之，在异位子宫内膜组织中，自噬表达水平上调伴有EMT现象的发生。我们推测，自噬表达上调可能促进异位子宫内膜组织上皮细胞EMT的形成，从而促进异位子宫内膜的黏附、侵袭和转移，最终导致异位病灶的发生、发展，抑制自噬可能作为预防和治疗子宫内膜异位症的新靶点，但其确切的机制有待深入探讨。