雷奈酸锶对抗地塞米松诱导大鼠骨质疏松的作用

黄歆，汪瑜，罗梅懿，宋永丹，杨浩森

作者单位：1成都市第七人民医院骨科，四川 成都 610000；2四川省人民医院骨科，四川 成都 610000

骨质疏松（osteoporosis，OP）是一种以骨量减少、骨组织微结构退化为特征，致使骨脆性增加和易于发生骨折的全身性骨代谢疾病［1］。该病多见于绝经后妇女、老年男性和多种慢性病病人，日益引起人们的重视。当前，治疗骨质疏松的药物主要有三类：①抑制骨吸收，如雌激素、降钙素（CT）、双膦酸盐；②促骨形成，如甲状旁腺激素（PTH）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）；③促进骨矿化，如钙剂［2］。雷奈酸锶是可以促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用新型药物，是近年来治疗和预防骨质疏松的药物研究热点［3］。为考察雷奈酸锶抗骨质疏松的药物作用及机制，本研究自2017年10月至2018年2月采用肌内注射地塞米松方式，建立大鼠骨质疏松模型，通过考察骨形态学以及血清相关骨代谢标志物，评估雷奈酸锶抗骨质疏松效果，为临床应用雷奈酸锶治疗提供客观的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及药物雷奈酸锶干混悬剂，每袋2 g，法国施维雅药厂，生产批号H20120291；地塞米松注射液，每支2.5 mg，Sigma公司，生产批号H44024469；Rat IL-6 ELISA检测试剂盒，Rat BALP ELISA检测试剂盒，Rat TRACP 5b ELISA检测试剂盒，Rat CTXI ELISA检测试剂盒，Rat OCN ELISA检测试剂盒，Rat HVD ELISA检测试剂盒；多聚甲醛、伊红液、苏木素（AR级）；MEM培养基、南美胎牛血清，等。

1.2 主要仪器Multlskan酶标仪（赛默飞世尔），DZKW-4电子恒温水浴锅（北京中兴伟业），UPH-Ⅱ-10T优谱超纯水（成都超纯科技）；转轮式切片机（徕卡-2016，德国），TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机（中威电子），BMJ-Ⅲ型包埋机（中威电子），PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（中威电子），BA400Digital数码三目摄像显微镜（麦克奥迪）；倒置生物显微镜AE31（麦克奥迪），MCO-15AC二氧化碳培养箱（三洋电机）；SYQ-DSX-280B压力蒸汽灭菌器（上海宜川），BN-200高精密电子天平（台湾巨林樱花）。

1.3 实验动物6～8周龄SPF级雌性SD大鼠30只；体质量（226±8）g；3月龄SPF级雌性SD大鼠24只，体质量（270±12）g，购于成都达硕实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（川2013-24），使用许可证号：SYXK（川2014-189）。动物处置符合动物伦理学要求。

1.4 大鼠骨质疏松模型制备及实验分组6～8周龄清洁级雌性SD大鼠30只，饲喂常规饲料，自由饮水，清洁级饲养。将大鼠随机分为5组：空白对照组（不做处理），模型组（每周2次地塞米松1 mg/kg肌肉注射），雷奈酸锶高剂量组（每周2次地塞米松1 mg/kg肌肉注射+每天1次灌胃雷奈酸锶800 mg/kg），雷奈酸锶中剂量组（每周2次地塞米松1 mg/kg肌注+每天1次灌胃雷奈酸锶600 mg/kg），雷奈酸锶低剂量组（每周2次地塞米松1 mg/kg肌肉注射+每天1次灌胃雷奈酸锶400 mg/kg），同室常规饲养5周，第5周最后1次给药结束后2 h，采集样本，用于指标检测。

1.5 左胫骨组织形态学测定处死大鼠，分离左胫骨，用4%多聚甲醛固定3 d，然后10%EDTA脱钙5周，用电锯从矢状面剖开，暴露骨髓腔并取左胫骨近端，制备常规脱钙骨组织蜡块，切4 μm厚骨组织切片，HE染色，光镜下观察骨形态改变，每张切片选取5个视野，取其平均值，利用MOTIC Med 6.0型图象分析系统进行骨组织形态测量，计算骨形态指标：平均骨小梁间距（Tb.sp），平均骨小梁厚度（Tb.Th）。

1.6 血清指标检测

1.6.1血清采集 处死大鼠前，在乙醚麻醉状态下从背部主动脉采集血液，血液收集后，4℃静置3 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清，分装于小EP管中，-70℃冷冻保存备用。

1.6.2指标检测 按试剂盒说明，采用ELISA法，检测血清白介素-6（IL-6）、血骨碱性磷酸酶（BALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP 5b）、I型胶原C端肽（CTX-I）、骨钙素（OCN）和25-羟维生素D（25-HVD）。

1.7 细胞指标检测

1.7.1载药血清的制备 按参考文献［4］方法，制备雷奈酸锶载药血清。取3月龄雌性SD大鼠24只，采用随机数字表法分为4组（n＝6）：雷奈酸锶低、中、高剂量给药组和空白对照组。雷奈酸锶剂量组，按人鼠体表面积法换算，以成人临床等效剂量的1、3、9倍剂量灌胃，对照组灌胃等体积的生理盐水。每天1次，连续给药7 d，末次给药后2 h，无菌操作，心脏取血，3 000 r/min离心30 min，分离血清，56℃水浴30 min灭活。采用0.22 μm滤器除菌，-70℃保存备用。用时以无血清DMEM稀释为10%浓度的含药血清。

1.7.2大鼠成骨细胞分离培养 按参考文献［4］，无菌条件下，取24 h内新生大鼠颅盖骨，去除骨缝及骨膜组织，用预冷的PBS清洗3次，之后用0.25%胰酶消化清除脂肪和软组织，剪成1 mm3的小块，0.1%胶原酶消化45 min，再用无血清DMEM冲洗，置20%小牛血清DMEM培养基中贴壁培养。

1.7.3雷奈酸锶对大鼠成骨细胞增殖的影响 消化收集成骨细胞，调节细胞密度为每毫升4×104个，按照每孔200 μL接种于96孔板，贴壁后，弃去原培养液，在相应的培养孔内分别加入高、中、低剂量的雷奈酸锶的含药血清及空白血清，每组均设6个复孔，培养24 h后，每孔加入200 μL 0.5%MTT溶液，继续培养4 h，再加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），置摇床上低速振荡10 min后，用酶标仪检测OD570nm处各孔的吸光值。

1.8统计学方法应用SPSS 20.0统计软件对所得数据进行统计处理，所有计量资料以xˉ+s表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较为HSD-q检验。检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 大鼠骨组织形态学观察HE染色结果提示，地塞米松模型组大鼠骨小梁变细、数量明显减少，排列疏松，甚至断裂，骨小梁结构出现较多大的空白区域；雷奈酸锶中、高剂量组（600，800 mg/kg）骨小梁变粗且致密，骨连续性较好，排列较为规则（图1）。MOTIC Med 6.0型图像系统分析，较模型组，雷奈酸锶中、高剂量组的平均骨小梁厚度明显升高（P＜0.05），骨小梁间距明显降低（P＜0.05）。见表1。

图1 各组大鼠骨组织（HE染色×200）：A为高剂量组；B为中剂量组；C为低剂量组；D为空白组；E为模型组

表1 雷奈酸锶对骨质疏松大鼠骨微结构的影响/（μm，±s）

表1 雷奈酸锶对骨质疏松大鼠骨微结构的影响/（μm，±s）

注：与模型组相比aP＜0.05，Tb.Th为平均骨小梁厚度，Tb.sp为平均骨小梁间距

组别 鼠数T b.T h T b.s p空白对照组模型组高剂量组中剂量组低剂量组F值P值6 6 6 6 6 5 3.9 2±3.3 9 a 3 8.0 0±2.3 6 5 2.0 0±4.4 4 a 4 8.5 0±4.0 5 a 4 0.8 4±3.1 2 2 3.0 6 4 0.0 0 0 1 4 2.0 6±1 1.1 5 a 1 8 9.9 0±1 9.2 7 1 5 0.0 2±2 0.8 6 a 1 5 4.2 6±1 3.8 6 a 1 7 4.6 0±1 1.7 1 9.1 5 8 0.0 0 0

2.2 血清指标检测模型组与空白组相比，所有检测指标均差异有统计学意义（P＜0.01），表明所选指标，具有良好的指示作用。雷奈酸锶高剂量组较模型组大鼠血清IL-6、BALP、TRACP 5b、CTX-I均明显降低（P＜0.05，P＜0.05），OCN、25-HVD明显升高（P＜0.05）。见表2。

2.3 大鼠成骨细胞增殖影响雷奈酸锶高、中、低含药血清组OD值和空白组比较，高、中剂量组有明显细胞增殖作用（P＜0.05）；低剂量组细胞增殖作用不明显（P＞0.05）。结果表明，高、中剂量雷奈酸锶载药血清对大鼠成骨细胞增殖有明显促进作用（表3）。

表2 清洁级雌性SD大鼠30只实验分组后各组相应指标变化情况/±s

表2 清洁级雌性SD大鼠30只实验分组后各组相应指标变化情况/±s

注：与模型组相比aP＜0.05，IL-6为白介素-6、TRACP 5b为抗酒石酸酸性磷酸酶5b、CTX-I为I型胶原C端肽、OCN为骨钙素，25-HVD为25-羟维生素D

组别空白对照组模型组高剂量中剂量低剂量F值P值鼠数6 6 6 6 6 IL-6/（ng/L）20.18±3.41a 24.36±1.54 21.25±1.79a 22.85±2.57 23.16±2.79 2.582 0.062 BALP/（ng/mL）1.35±0.15a 3.48±0.51 2.31±0.21a 2.94±0.42 3.09±0.72 20.433 0.000 TRACP 5b/（U/L）2.85±0.71a 5.70±0.94 4.18±0.95a 4.51±0.78a 4.73±0.66 9.569 0.000 CTX-I/（ng/L）187.87±29.95a 357.16±36.90 279.73±43.69a 305.98±50.58 325.45±42.85 14.499 0.000 OCN/（ng/mL）6.08±0.73a 4.37±0.95 5.62±1.05a 5.00±0.40 5.18±0.99 3.407 0.024 25-HVD/（ng/mL）27.78±2.43a 20.94±2.97 24.51±1.11a 23.34±2.49 22.83±3.66 5.414 0.003

表3 雷奈酸锶对大鼠成骨细胞增殖的影响/±s

表3 雷奈酸锶对大鼠成骨细胞增殖的影响/±s

注：剂量组与空白对照组相比，aP＜0.05

组别 鼠数O D值空白对照组高剂量组中剂量组低剂量组F值P值6 6 6 6 0.3 8±0.0 1 0.4 5±0.0 2 a 0.4 0±0.0 2 a 0.3 9±0.0 1 2 5.2 7 0 0.0 0 0

3 讨论

骨质疏松是系统性骨骼性疾病，西医认为，其发病机制在于骨形成代谢过程中，骨吸收和骨形成发生失衡。临床表现为骨小梁变细变薄，断裂，数量减少，孔隙变大，生物力学性能降低，骨密度下降，往往伴随骨微观结构退化和骨量降低，骨脆性增加，病人易发生骨折［5］。雷奈酸锶化学名为5-［二（羧甲基）氨基］-3-羧甲基-4-氰基-2-噻吩羧酸二锶盐，是由稳定态锶原子和有机雷奈酸组成［6］，新型的抗骨质疏松药物。本研究以地塞米松诱导大鼠骨质疏松为病理模型，首先考察了不同剂量的雷奈酸锶对模型鼠骨形态学影响。骨质疏松症的重要特征是骨组织显微结构退化。骨小梁的数量、骨连续性、排列构象以及平均骨小梁间距、平均骨小梁厚度等显微结构影响着骨的生物力学特性，因此骨显微结构指标的改变可以更直接地反映骨质疏松的情况。骨组织病理学检测是反映骨显微结构变化的最直接的依据，评价骨显微结构的金标准［7］。本实验结果表明，雷奈酸锶高剂量组的骨小梁变粗且致密，骨连续性较好，排列较为规则，相比对照组，可以显著改善骨小梁间距、平均骨小梁厚度。提示雷奈酸锶对改善显微结构具有一定的疗效。

本研究还考察了雷奈酸锶对骨代谢血清标志物以及对成骨细胞增殖的影响。IL-6、BALP、5b（TRACP 5b）和CTX-I是骨质疏松的指示性血清指标。IL-6可由造血干细胞、破骨细胞、成骨细胞等多种细胞分泌，是调节骨代谢的重要蛋白质因子之一。IL-6不仅可直接刺激骨吸收，还能刺激骨髓的多核细胞呈现破骨细胞的表现型，加速骨吸收［8］。临床研究也证实：骨质疏松病人血清IL-6水平明显高于同龄正常人［9］。BALP由成骨细胞分泌，在成骨过程中BALP水解膦酸酯，促进基质矿化［10］，骨质疏松病人BALP活性增高［11］。TRACP在血液循环中，有两种形式：TRACP5a和TRACP5b，其水平大体相等［12］。血清TRACP5a来源于巨噬细胞，是细胞活跃状态的标志［13］；而血清TRACP5b虽然可来源于巨噬细胞和破骨细胞，但由激活的巨噬细胞分泌的TRACP5b无酶活性，只有破骨细胞来源的TRACP5b才具有酶活性，因此TRACP5b可作为破骨细胞数量和骨吸收的有效标志物［14-15］。临床研究表明，骨质疏松病人，血清TRACP5b活性增高［16-18］。骨纤维主要是由Ⅰ型胶原蛋白形成，CTX-I可反映破骨细胞活性及骨吸收的指标，临床上骨质疏松病人CTX-I升高，其是骨转换标志物中首选的风险评估指标［19-21］。本实验模型组血清IL-6、BALP、5b（TRACP 5b）和CTX-I均显著高于正常组，从指示性血清指标的角度印证了骨质疏松造模成功，雷奈酸锶高剂量组可显著降低上述血清指标，对抗骨质疏松导致的指示性血清指标的上升。OCN是由成骨细胞合成分泌的一种特异性非胶原蛋白，当骨形成和骨吸收去耦合时是骨形成的特异性标志物［22］；25-HVD虽然不能直接反映出成骨细胞和破骨细胞的活性，但是由于其能调节钙、磷的代谢，因此其对骨代谢也有重要影响［23］。临床上骨质疏松病人的血清OCN和25-HVD均降低［24-25］。本实验结果表明，高剂量的雷奈酸锶可显著的改善血清OCN和25-HVD，对抗骨质疏松导致的其血清水平降低。体外培养的成骨细胞因具有与体内成骨细胞相同的生物特性，体外培养成为研究骨代谢和成骨机制的重要手段。本研究实验表明，雷奈酸锶可促进体外成骨细胞增殖。

雷奈酸锶可改善骨微细结构和骨组织形态结构，降低血清IL-6、BALP、5b（TRACP 5b）、CTX-I，提升血清骨钙素、25-羟维生素D，同时能够促进成骨细胞增殖，抑制骨吸收和促进骨形成，发挥对骨的保护作用，具有治疗骨质疏松的作用。（本文图1见插图9-2）