外用鹿茸膏剂抗小鼠皮肤衰老的实验研究

郁兵，何凤琴，杨章民

作者单位：1西安文理学院生物与环境工程学院，陕西 西安 710065；2陕西师范大学生命科学院，陕西 西安 710061

鹿茸是梅花鹿或马鹿的成年雄鹿处于生长期、未骨化的幼角，是一味被祖国医学数千年实践所验证的名贵中药，其性温、咸，味甘，具有壮肾阳、益精血、强筋健骨、调冲任、托疮毒的作用［1］。鹿茸在生长阶段生长速度很快，最多每天可以生长1～2 cm，其原因在于内部含有大量复杂的生物活性物质。近年来对中药材抗衰老的研究非常多，如：人参、黄芪、枸杞、黄精等，现代生物学对鹿茸的研究也证明了鹿茸具有抗衰老功效［2-5］，但是对应用鹿茸全组份抗皮肤衰老的研究并不多见。本文作者认为，鹿茸是一种成分非常复杂的中药材，其抗衰老很可能是多种组份互相协同产生的功效，本课题自2018年1月至2019年5月研究外用鹿茸抗皮肤衰老的功效，为进一步将鹿茸开发成抗皮肤衰老化妆品提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级雌性昆明种小鼠30只，体质量（20±2）g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，使用许可证号：SCXK（陕）2018-001，合格证号：61001700003029。由于本研究最终目的是为了研制适用于女性的抗皮肤衰老化妆品，所以全部选用雌性小鼠作为实验动物。小鼠的处置符合动物伦理学原则。

1.2 试验药物和主要试剂成年梅花鹿茸最多可以分枝两次，第一次分枝后叫做二杠茸，该阶段是鹿茸生长旺盛时期，粗灰分含量低，含有较多活性物质。根据鹿茸不同部位组织特征的差异，鹿茸切片由顶端向下依次为蜡片、粉片、血片和骨片，越靠近顶端的茸片，品质越高。试验用鹿茸由本课题组成员到项目合作方铜川鹿苑实业有限公司现场割取，并取其中下部颜色鲜红、血液丰富的切片——血片为试验药物。血片靠近鹿茸基部，品质中下，能够代表鹿茸的基本药效［6］。

HA测定试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；HYP测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；SOD测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；D-半乳糖，上海化学试剂二厂；考马斯亮兰，南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器超微量微孔板分光光度计（Epoch，美国Bio-Tek公司）；台式高速离心机（SF-TGL-16GS，上海菲恰尔分析仪器有限公司）；冷冻干燥仪（CTAL PH2-4/LSC，德国CHRIST公司）；远红外快速恒温干燥箱（YHG-400-S，上海跃进医疗器械有限公司）；恒温水浴锅（SHHW21.420AⅡ，天津市泰斯特仪器有限公司）；粉碎机（FSJ-A05N6，广东小熊电器有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1分组与造模 首先将雌性小鼠适应性饲养7d，保证小鼠适应现环境后开始进行实验。

将30只雌性小鼠按照随机数字表分组的方法分成5组，其中4组小鼠作为造模组，皮下注射D-半乳糖1.0 g·kg-1·d-1，一共注射30 d；余下一组小鼠作为空白组，每天注射同体积生理盐水［7-9］。30 d后造模组和空白组皮肤外观比对，模型组明显皮肤松弛，出现细密皱纹，而空白组则相反，见图1。

图1 皮肤衰老模型的建立：A为空白组小鼠；B为模型组小鼠

将4组皮肤衰老模型小鼠分为：模型组、鹿茸膏剂A、B、C组。用剪刀将小鼠背部毛发剪短，再用剃须刀剃毛备用。

1.4.2制备鹿茸膏剂 将鹿茸血茸片100 g剪切成碎片，粉碎机高速档粉碎10次，每次1 min。精确称取粉碎后的鹿茸组织和凡士林，充分搅拌混匀，配制成模型组（0%）、鹿茸膏剂A组（5%）、鹿茸膏剂B组（10%）、鹿茸膏剂C组（15%）4个浓度鹿茸膏剂各50 g，置于冰箱冷藏室中保存。

1.4.3皮肤外用鹿茸膏剂 选取小鼠背部中央位置4 cm×7 cm的区域，将各组膏剂涂抹在对应各组小鼠选取的皮肤区域表面，每只每天涂抹0.3 g，24 h后清洁皮肤并再次涂抹，连续涂抹21 d，期间还需手工脱毛4次。

1.4.4小鼠皮肤的表观特征观察 比对各组小鼠用药部位皮肤的色泽、光滑程度、皱纹等表观特征并拍照记录。然后脱颈法处死实验小鼠，迅速剥下用药部位皮肤，去除皮下脂肪和其他结缔组织，铺平后用直径2 cm打孔器在正中位置切取小鼠皮肤用于含水率测定，余下的皮肤于-20℃冷冻保存，用于测定HYP等成分。

1.4.5皮肤含水率的测定 精确称量打孔器切取的皮肤湿重，随即将其放入烘箱中，于50℃烘干12h，然后称取干重，计算出各实验组皮肤含水率。公式如下：

1.4.6皮肤羟脯氨酸（HYP）含量测定 取涂药部位皮肤组织0.5 g，用冰浴预冷的生理盐水进行漂洗，滤纸擦干，加入冰浴预冷的生理盐水，使用玻璃匀浆器研磨成浓度为10%的匀浆液。将得到的匀浆液在0℃下3 000 r/min离心10 min，取上清液。按照HYP试剂盒说明书所示方法，使用超微量微孔板分光光度计测定OD值，计算各实验组小鼠皮肤HYP含量。

1.4.7皮肤透明质酸（HA）含量测定 取涂药部位皮肤组织0.5 g，加入冰浴预冷的PBS缓冲溶液，使用玻璃匀浆器研磨成浓度为10%的匀浆液。将得到的匀浆液在0℃下1 000 r/min离心4 min，取上清液。按照HA试剂盒说明书所示方法，使用超微量微孔板分光光度计测定OD值，计算各实验组小鼠皮肤HA的含量。

1.4.8皮肤超氧化物歧化酶（SOD）活力的测定 取涂药部位皮肤组织0.5 g，用冰浴预冷的生理盐水进行漂洗，之后加入冰浴预冷后的生理盐水，使用玻璃匀浆器研磨成浓度为10%的匀浆液。将得到的匀浆液在0℃下3 000 r/min离心10 min，取上清液。按照SOD试剂盒说明书所示方法，使用超微量微孔板分光光度计测定OD值，计算各实验组小鼠皮肤SOD活力。

1.5统计学方法运用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计量数据采用±s表示；组间比较采用单因素方差分析；方差齐性检验结果显著，两两比较采用Dunnett T3检验；方差齐性检验结果不显著，两两比较采用LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 五组小鼠皮肤组织含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力的测定/±s

表1 五组小鼠皮肤组织含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力的测定/±s

注：与模型组相比较，aP＜0.01，bP＜0.05

?组别鼠数皮肤含水率/%羟脯氨酸含量/（μ g/m g）透明质酸含量/（μ g/m L）S O D活力/（U/m g）空白组模型组鹿茸膏剂A组鹿茸膏剂B组鹿茸膏剂C组F值P值事后检验（两两比较）6 6 6 6 6 7 5.4 4±0.7 3 a 5 7.7 2±0.8 9 6 6.2 2±1.2 1 b 6 8.8 2±0.6 4 a 7 0.7 0±1.0 5 a 3 8 4.3 3 0.0 0 0 L S D 4.1 6 8±0.0 6 a 3.6 0 4±0.2 0 3.8 5 0±0.3 8 3.9 5 6±0.1 2 b 4.0 8 0±0.1 2 a 1 0.8 4 0.0 0 0 D u n n e t t T 3 9.2 7 3±0.2 9 a 6.1 6 3±0.5 4 6.1 6 4±0.8 0 8.5 1 4±0.6 3 b 9.0 2 4±0.2 4 a 2 5 4.2 0 9 0.0 0 0 D u n n e t t T 3 3 6 5.8 0±1 6.2 5 9 a 3 0 4.8 4±1 2.0 2 6 3 3 8.3 6±7.8 4 8 b 3 5 3.1 2±5.9 6 4 a 3 5 7.2 0±1 0.6 3 4 a 3 4.9 7 5 0.0 0 0 L S D

2 结果

2.1 皮肤外观比较观察各组小鼠皮肤发现：与空白组动物比较，模型组小鼠皮肤松弛，有大量褶皱，体毛再生较慢。涂抹了鹿茸膏剂的三组小鼠与模型组相比，在皮肤褶皱、光滑、松弛等方面都有较为明显的改善，改善效果随鹿茸含量增高而增强，以鹿茸膏剂C组最佳，结果见图2。

图2 各实验组小鼠皮肤外观的比较：A为模型组；B为鹿茸A组；C为鹿茸B组；D为鹿茸C组

2.2 鹿茸对小鼠皮肤含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力的影响测定五组小鼠皮肤组织含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力测定结果见表1。模型组小鼠皮肤组织含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力均显著低于空白组（P＜0.01），说明小鼠的皮肤衰老模型造模成功。鹿茸膏剂A组在皮肤含水率和SOD活力方面显著高于模型组（P＜0.05），在HYP和HA含量方面与模型组差异无统计学意义（P＞0.05）。鹿茸膏剂B组在皮肤含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力方面显著高于模型组（P＜0.05），在皮肤含水率和SOD活力方面和模型组差异有统计学意义（P＜0.01）。鹿茸膏剂C组在皮肤含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力方面和模型组差异有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

本实验的结果发现空白组小鼠的皮肤光滑，较为紧致，富有弹性。注射D-半乳糖的皮肤衰老模型小鼠皮肤松弛，皱褶大量增多，在皮肤含水率、羟脯氨酸含量、透明质酸含量、超氧化物歧化酶活力等指标明显下降。经测定，模型小鼠在外用鹿茸膏剂后，10%和15%浓度鹿茸膏剂组小鼠皮肤外观改善的效果明显，而且这两个浓度组小鼠皮肤的含水率、透明质酸含量、羟脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活力等指标也得到了显著提高。

衰老机制的假说有很多，一般认为，自由基普遍存在机体内，随着机体的衰老，皮肤组织具有抗氧化功能的过氧化物歧化酶等成分含量下降，导致自由基大量积累，过量的自由基会过氧化蛋白质、核酸、脂质等细胞成分，从而破坏细胞膜、线粒体、染色体等细胞结构，引起蛋白质交联变性和DNA链断裂；而皮肤成纤维细胞功能的衰退，会引起羟脯氨酸生成减少，胶原蛋白合成减少，透明质酸含量下降。这些伤害在皮肤组织学方面表现为：表皮和真皮层变薄，真皮内的胶原蛋白减少，透明质酸含量下降，皮肤含水率下降，胶原纤维交联，脂褐素堆积；于是皮肤外观出现干燥、松弛、皱纹、暗沉等衰老症状［10-11］。

鹿茸本身就是处于快速生长阶段的幼角，因此内部含有大量促进组织生长的生物活性物质，鹿茸的成分包括蛋白多肽类、氨基酸、糖类、生物胺类、甾体类、脂类和无机元素。蛋白多肽类是鹿茸最主要的活性成分，与抗衰老有关的主要是酶类和生长因子类。酶类包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、单胺氧化酶（MAO）等，这些酶类具有抗氧化、抗衰老作用。胰岛素样生长因子、表皮生长因子等能够促进皮肤成纤维细胞的功能，增加胶原蛋白和透明质酸的合成。鹿茸中的糖类包括硫酸软骨素、酸性黏多糖、中性糖、半乳糖胺等，这些成分往往具有抗氧化或者保湿的作用。鹿茸多胺可以抗脂质过氧化，促进核酸和蛋白质合成。鹿茸中的甾体类包括雌二醇、胆甾醇、5a-雄甾烷-1，3-二酮、睾丸酮、胆甾-3，5-二烯，5a-胆甾-7-烯-3-酮等成分，这些激素类成分能够抑制黑色素细胞络氨酸酶活性、促进成纤维细胞增生和增加胶原蛋白和透明质酸合成、抑制炎症形成、延缓皮肤衰老［12-15］。由此可见，鹿茸所含活性成分复杂多样，其抗衰老是多种组份互相协同产生的功效，而且外用全组分鹿茸，可以起到很好的抗皮肤衰老的效果。本研究证明，鹿茸可能是一种良好的抗皮肤衰老的天然药物。

（本文图1，2见插图9-1）