E26转化特异性同源因子EHF/ESE3在肿瘤中的研究进展*

刘静 郝继辉

E26 转化特异性同源因子［ETS（E26 transformation-specific）homologous factor，EHF］，又称为上皮特异性转化因子3（epithelium-specific ETS factor family member 3，ESE3）属于ETS 超家族的ESE（epitheliumspecific ETS transcription factor）亚家族，广泛存在于细胞核内，属于转录调控因子，能够单独或与其他效应分子形成转录复合物增强或抑制下游基因的转录，对细胞增殖、发育、分化、凋亡、衰老起到重要的调节作用［1］。近年来，多项研究表明EHF作为转录因子在肿瘤的发生发展及免疫微环境调控中扮演重要角色，具有一定的临床转化价值。因此，本文针对EHF 在肿瘤实质以及免疫微环境中的功能及机制进行综述。

1 EHF概述

EHF/ESE3 位 于 染 色 体11p13，分 为ESE3a、ESE3b 和ESE3j 三个亚型。ESE3a 编码277 个氨基酸，32 kDa；ESE-3b编码300个氨基酸，35 kDa；ESE3j编码322 个氨基酸，37 kDa。EHF 主要依赖于其ETS结构域及PNT结构域发挥功能。ETS结构域有85个氨基酸，形成翼状螺旋-转角-螺旋的DNA结合基序，该区域通过与靶基因启动子区特异性结合调控下游基因的转录，引发细胞生物学功能改变［2］。EHF一般结合于启动子区5′-GGAA/T-3′对下游基因产生转录调控，但当其与其他转录因子发生相互作用时，也可结合于非经典基序，如5′-GGAG-3′［2］。PNT 结构域包含80个氨基酸，位于N末端，其主要作用是介导蛋白质-蛋白质相互作用、激酶对接、RNA结合、脂质分子相互作用以及转录激活［3-4］。

2 EHF在肿瘤实质中的作用

目前针对EHF研究较多的肿瘤是前列腺癌及胰腺癌，均为抑癌基因；EHF 在不同的肿瘤中发挥的作用不尽相同，对于同一个信号通路在不同的癌肿背景下甚至发挥相反的作用。表1 总结了EHF 在不同肿瘤中的作用及影响的信号通路机制。EHF 在不同肿瘤中的作用差异原因尚不明确，其可能原因有以下几点：ETS家族转录因子作用的发挥受RAS/MAPK信号通路状态的影响［3］。ETS 家族转录因子结合位点（ETS-binding-sit，EBS）附近常伴有AP1 转录因子结合位点［3，5］。AP1表达水平升高能够使EHF与EBS的结合能力降低至原1/20；AP1 敲除后，EHF 与EBS结合变得紧密［5］。EBS 核心序列GGAA 前方的一个单核苷酸具有多态性，能决定EBS与ETS家族不同转录因子的亲和力，如将SCI1 基因的启动子区核心序列GGAA 前方核苷酸C 改变为A 将引起ERG 与DNA的结合能力下降8 倍，EHF 与DNA 结合能力下降1.9 倍［5］。

2.1 EHF与前列腺癌

EHF 为前列腺癌发生发展过程中的一个重要抑癌基因，在抑制前列腺癌上皮间质转化、干性维持、增殖以及化疗耐药等方面均发挥重要作用。Albino等［6］发现在前列腺癌发生早期即可出现EHF 表达降低。对永生化的正常前列腺上皮细胞系PrECs 进行EHF 基因敲除后，细胞将发生上皮间质转化，细胞运动能力、悬浮成球能力以及对失巢凋亡的抵抗能力均显著增加。在抑制前列腺癌干性表型方面，EHF可直接转录抑制经典干性调控分子TWIST1、ZEB2、POU5F1/OCT4、Nanog、BMI1 等。IL-6 为一种重要的促癌因子，不仅能够通过激活JAK-STAT3 通路促进肿瘤干性表型，也是诱导MDSC及Treg聚集的重要免疫微环境调控因子。EHF能够直接结合于IL-6这一重要促癌因子的启动子区抑制其转录，抑制STAT3磷酸化，抑制干性表型［7］。同时，EHF 是Lin28/let-7双向负反馈环路中的关键分子。let-7 miRNAs 是经典的抑癌基因，Lin28 具有抑制let-7 miRNAs 成熟的作用。EHF 在下调Lin28 的同时，还能直接作用于let-7启动子区上调其表达，而上调的let-7又可以作用于Lin28 的3′UTR 区域使Lin28 表达下调［8］。在影响前列腺癌细胞凋亡方面，Cangemi 等［9］发现EHF 能够直接结合于Caspase3的启动子区上调其表达水平，进而诱导细胞凋亡。同时，该研究指出EHF 的表达水平受甲基化影响，给予地西他滨处理后，前列腺癌细胞EHF 表达水平显著升高［9］。在化疗耐药方面，EHF 缺失是前列腺癌紫杉醇化疗耐药的原因之一。EHF可直接转录抑制神经元特异性蛋白DCDC2的表达，而DCDC2 可以与α-tubulin 发生相互作用引起紫杉醇化疗耐药。因此，EHF 缺失有望成为前列腺癌紫杉醇化疗耐药的预测因素，在前列腺癌中联合升高EHF的治疗方案有望逆转紫杉醇耐药［10］。

表1 EHF在不同肿瘤中的作用及靶点

除了对执行分子进行直接转录调控进而发挥抑癌作用之外，EHF 可通过影响泛素化及甲基化过程中的关键分子来发挥作用。Dallavalle 等［8］研究发现EHF 促进重要癌基因泛素化降解进程。COP1 为E3泛素连接酶，其高表达能够促进STAT3、ETV1 和c-JUN 泛 素 化，miRNA-424 能 够 作 用 于COP1 的3′-UTR 抑制COP1翻译。EHF 能够结合于MIR424的启动子区转录抑制miRNA-424表达，进而引起COP1表达升高，促进STAT3、ETV1 和c-JUN 蛋白的泛素化，发挥了重要的抑癌作用。Kunderfranco 等［11］研究发现EHF 抑制抑癌基因甲基化沉默过程。EZH2 通过对组蛋白3第27位赖氨酸的三甲基化使得染色体结构凝集，从而实现对相关靶基因的转录抑制。EZH2在多种肿瘤中表达上调，而EHF 能够直接结合于EZH2 的启动子区转录抑制EZH2 表达，上调抑癌基因Nkx3.1，抑制前列腺癌发生发展。

2.2 EHF与消化系统肿瘤

本课题组针对EHF在胰腺癌中的作用开展了系列性研究，首次发现EHF 为胰腺癌的重要抑癌基因。对胰腺癌癌与癌旁组织配对组织芯片进行免疫组化染色，发现胰腺癌EHF 表达水平显著低于癌旁组织，且EHF表达与组织学分级，淋巴结转移以及脉管癌栓具有负相关关系。EHF低表达为较短OS和较短RFS 的独立危险因素。EHF 能够抑制胰腺癌的侵袭迁移能力，其主要机制在于EHF 能够直接结合于E-cadherin 的启动子区，上调其表达，从而抑制胰腺癌上皮间质转化进程，抑制转移［12］。在乏氧以及低糖环境中胰腺癌EHF 下调［13］。在食管癌中，EHF 为抑癌基因，其在正常食管组织和食管癌中的分布位置不同。在正常食管组织中，EHF位于细胞核；而食管癌虽有EHF 表达但位于胞质。体外实验表明，在食管癌细胞系中转染EHF 使其过表达后，EHF 入核也相对增多，进而食管癌细胞增殖能力及侵袭迁移能力均显著减弱［14］。在结肠癌中，EHF 在多数研究中为抑癌基因。Lim 等［15］研究表明EHF 能够结合于死亡受体5（death receptor 5，DR-5）基因的启动子区上调其表达促进细胞凋亡。聂娜等［16］采用免疫组织化学法检测76例结肠癌癌组织与癌旁配对组织标本的EHF 表达水平，结果表明EHF 在癌旁组织中的表达明显高于相应结肠癌组织，且EHF 低表达或缺失提示较差的病理分期及分化程度。该研究者通过体外实验证实EHF抑制结肠癌细胞增殖能力及克隆形成能力，并指出EHF 为结肠癌抑癌基因［17］。但有研究表明，EHF 能够上调RUVBL1 的表达，进而抑制P53的表达及P53诱导的细胞凋亡［18］。

在口腔鳞状细胞癌中，EHF 为一重要促癌基因，其能够结合于角蛋白16 的DNA 启动子区促进其转录，角蛋白16能够促进β5-整联蛋白和c-Met的稳定性并激活Src/STAT3信号［19］。在胃癌中，EHF 表达较正常胃组织明显增加，其高表达与患者的恶性预后密切相关。体外实验也证实，在胃癌细胞中敲低EHF 后，细胞的克隆形成能力以及侵袭转移能力显著减弱，细胞周期阻滞，增殖能力下降，凋亡增加。机制上，EHF 能够与HER2 启动子区结合促进其转录，并激活MAPK/Erk 及PI3K/Akt 通路［20］。徐勇超等［21］通过体内外实验研究表明EHF在胃癌细胞株中高表达，下调EHF表达水平后，胃癌细胞的增殖及侵袭迁移能力均显著受到抑制。此外，胃癌细胞EHF高表达能够引起其对5-氟尿嘧啶产生化疗耐药［22］。靶向EHF的治疗有可能成为胃癌治疗以及逆转5-氟尿嘧啶耐药的潜在靶点。

2.3 EHF与卵巢癌

EHF 在卵巢癌中为一癌基因，癌组织中EHF 表达显著高于癌旁。EHF 高表达可以激活AKT 通路，使CyclinD1和p21表达水平显著增高，细胞增殖速度加快；同时，EHF高表达激活ERK通路，引起ICAM及MMP2 表达水平增高，细胞侵袭迁移能力增加［23］。Brenne 等［24］对卵巢癌腹水瘤细胞及恶性间皮细胞瘤腹水瘤细胞的EHF表达水平进行了QPCR检测，发现卵巢癌腹水瘤细胞EHF的mRNA 水平显著高于恶性间皮细胞瘤腹水瘤细胞，并指出卵巢癌中EHF 高表达是预后较差的独立危险因素。

2.4 EHF与头颈及乳腺肿瘤

在甲状腺癌及乳腺癌中，EHF 为癌基因。在甲状腺癌组织中，EHF 表达显著高于正常组织。体内外实验表明，EHF 促进甲状腺癌增殖、侵袭、迁移等恶性表型并抑制肿瘤凋亡；其机制在于，EHF能够结合于HER2 与HER3 基因的启动子区促进其表达，并激 活PI3K/Akt 和MAPK/Erk 通 路［25］。Novoplansky等［26］研究发现EHF是引发头颈部鳞癌西妥昔单抗治疗诱导性HER2 及HER3 上调的关键分子。肿瘤细胞在接受西妥昔单抗治疗后出现HER2 及HER3 的上调，引起靶向治疗耐药；但敲除EHF 后，给予西妥昔单抗治疗不再诱发HER2 及HER3 上调，提示在西妥昔单抗治疗同时抑制EHF有望减少西妥昔单抗治疗耐药的产生。Galang 等［27］采用小鼠乳腺癌移植瘤模型，对正常小鼠乳腺组织与小鼠乳腺癌组织进行QPCR检测，发现小鼠乳腺癌组织中EHF的表达高于正常乳腺组织。He等［28］对10种常见乳腺癌细胞系、2 种永生化乳腺正常上皮细胞系以及一种原代乳腺上皮细胞针对ETS家族基因表达水平进行了Q-PCR检测，发现与正常细胞相比乳腺癌细胞EHF 表达水平显著升高。

3 EHF与免疫微环境

本课题组最新研究［29］发现EHF对胰腺癌免疫微环境状态具有重要的调控作用。通过回顾性研究人胰腺癌组织标本96例以及前瞻性收集人胰腺癌新鲜组织标本45例，发现EHF与Treg、MDSCs的聚集水平呈显著负相关，与CD8+T 细胞的聚集呈显著正相关。其机制在于EHF能够直接结合于重要免疫抑制因子TGFβ1以及GM-CSF基因的启动子区抑制其转录，进而抑制Treg细胞以及MDSC的诱导、增殖以及免疫抑制能力。EHF 是一个潜在的胰腺癌免疫微环境状态的评估指标，其表达水平有望指导胰腺癌免疫精准治疗方案选择；即对于胰腺癌EHF 高表达人群适宜给与单药抗PD-1治疗；而对于EHF缺失的胰腺癌患者可能适于Treg、MDSCs 清除方案联合抗PD-1 治疗［29］。王翔等［30］采用Transwell 小室对结肠癌细胞以及结肠癌过表达EHF的细胞分别与树突细胞进行间接式共培养，发现结肠癌过表达EHF 的肿瘤细胞能够促进树突细胞分化成熟。在肺上皮细胞中EHF能够抑制DDAH1表达从而促进肺上皮损伤后的炎症反应；同时，EHF 敲除后ITGA2，S100A8、S100A9、MMP表达下调引起免疫微环境改变，损伤修复延迟［31-33］。在肺癌细胞中，EHF 敲除引起CXCL6 和CXCL8 的表达升高，促进中性粒细胞的聚集［31］。

EHF上调黏膜免疫过程关键基因HCK及跨膜受体CD300LF，促进胞吞过程［34］。在肥大细胞中，EHF介导Ⅰ型超敏反应过程。肥大细胞表面主要标记分子为高亲和力IgE Fc 受体FcεRI 以及干细胞因子受体c-Kit。FcεRI由1个α亚基，1个β亚基和2个γ亚基组成，EHF 能够直接转录抑制α 亚基编码基因Fcer1a，以及β 亚基编码基因Ms4a2，进而抑制FcεRI 生成；EHF也能直接转录抑制c-Kit，抑制肥大细胞的作用，进而改变免疫微环境状态［35］。EHF 在成熟的树突细胞中高表达，为树突细胞成熟的标记之一［36-37］。EHF 的启动子区存在多个PPARγ 结合位点，加入PPARγ 受体激动剂，如曲格列酮、罗格列酮、吡格列酮等均可以转录激活EHF 的表达诱导树突细胞成熟［37］。因此，针对EHF 的治疗不仅能够对肿瘤的实质产生作用，也对免疫微环境的调控具有重要影响。

4 总结与展望

综上，EHF 为ETS 家族的转录因子，尽管与其他ETS 家族转录因子同样结合于靶基因启动子区5′-GGAA/T-3′位点，但常发挥其他ETS家族转录因子相反的作用。EHF 在前列腺癌以及胰腺癌中的抑癌作用较为明确，有望成为临床预后判断以及免疫治疗的重要分子标记。EHF 在不同的肿瘤中发挥作用不尽相同，需要建立基因敲除鼠模型对其功能进行进一步探究。PPARγ 受体激动剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂以及DNA甲基转移酶等均能够上调EHF的表达水平，有望成为临床针对EHF 表达进行临床转化的方向。