基于脂质组学探索狼疮定调节MRL/lpr狼疮鼠肝脏脂代谢紊乱的作用

卢璐 赵燕霞 胡长锋 李海昌 谢冠群*

系统性红斑狼疮（SLE）是一种累及泌尿、血液、心血管等系统以及全身多个器官的自身免疫性疾病［1-2］。血脂异常引起的动脉粥样硬化（AS）及相应心血管事件是当前导致SLE患者死亡的主要原因之一［3-4］。SLE患者肝脏脂质代谢异常，致使存在特有的“狼疮型”血脂异常［5］；并且血脂异常与自身性抗体、炎症因子的分泌具有显著的相关性［6］。同时，SLE最常用的治疗药物糖皮质激素（GCs）会加剧糖脂代谢的紊乱。狼疮定是在长期临床实践中提出解毒祛瘀滋阴法治疗SLE的基础上形成的经验方，在临床和动物研究中均证实具有控制疾病活动性以及减轻GCs导致的糖脂代谢紊乱等副作用的功效［7-8］。2017年8月至9月作者应用多维质谱“鸟枪”法脂质组学（MDMS-SL）技术对MRL/lpr狼疮鼠肝脏组织中脂质分子进行全面地定性定量分析，探讨狼疮定的调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 （1）狼疮定：青蒿12g、干地黄15g、炙鳖甲12g、升麻9g、白花蛇舌草15g、赤芍12g、积雪草15g、炒薏苡仁15g、佛手片9g、生甘草6g。（2）药物与试剂：强的松（浙江仙居制药）。脂质标准品购自Avanti和Nu-Chek公司。化学试剂甲醇和氯仿均为色谱纯，其余为试剂纯。BCA试剂盒来自美国Thermo Scientific公司。（3）实验动物：上海实验动物中心提供的6周龄MRL/lpr雌性小鼠，C57BL/6雌性为正常对照，均为SPF级，自由摄食、水饮，饲养环境完全相同。所有实验操作均按照国家相关的实验动物饲养和使用条例，遵照浙江中医药大学动物伦理学条例。

1.2 仪器与设备 美国Thermo Fisher Quantiva质谱仪；美国Advion 纳喷离子源；杭州奥盛仪器有限公司WD-12氮吹仪；美国Thermo Fisher多功能酶标仪。

1.3 实验方法（1）实验小鼠分组：所有小鼠适应性喂养2周后，MRL/lpr小鼠随机分为4组，分别为模型组、激素组、狼疮定组和中西医结合组，6只/组。C57BL/6为正常对照组。激素组：强的松10mg/kg给药；狼疮定组：狼疮定3.15g/kg；中西结合组：狼疮定和激素均按原剂量等量混合配制成混悬液，每只小鼠均灌胃0.3ml；正常对照组灌胃0.3ml高纯水。各组均连续干预10d。（2）肝脏组织采集：10d后，将每组小鼠处死采集肝脏组织，每只小鼠收集同一位置的肝脏部位，切开后用PBS溶液冲洗干净，分装，用球磨仪将各肝脏组织研成粉末，每个称取25mg左右分别溶于1000ml PBS溶液中，超声进一步粉碎处理，置于-80℃，备用。（3）肝脏脂质提取物的制备：按照文献，该实验采用氯仿/甲醇溶剂体系对各肝脏中的脂质进行提取［10］。（4）MDMS-SL分析：根据前期已经建立的方法分析提取物中各类脂质［9-11］。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以（）表示，两组间比较用t检验，多组间比较用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肝脏中酰基肉碱类和4-羟基壬烯醛（HNEs）脂质的变化 本实验共检测13种酰基肉碱类脂质。结果表明，与正常对照组比，模型组小鼠肝脏中各类酰基肉碱类脂质均显著升高，总量从正常组的（8.71±1.36）pmol/mg提高至模型组的（13.4±0.73）pmol/mg蛋白（P＜0.05）。对各组小鼠肝脏组织HNEs进行定性定量分析。与正常组相比，模型组小鼠肝脏中HNEs的含量明显升高。见图1。

图1 各组小鼠肝脏组织中酰基肉碱类脂质和4-羟基壬烯醛类总含量

2.2 各组小鼠肝脏中TAGs含量的变化 利用MDMSSL方法对各组小鼠肝脏中36种TAGs分子进行定性定量分析。结果表明，与正常组比，模型组、激素组和中西医结合组小鼠肝脏中TAGs总含量出现不同程度下降。模型组小鼠肝脏TAGs总含量降低，可能与SLE肝脏对乳糜微粒中TAGs吸收和降解能力减弱有关，导致血液系统中TAGs无法被及时利用，造成一定程度的积累。经单纯狼疮定干预后，肝脏内TAGs含量可以恢复到接近正常水平，该结果表明狼疮定对SLE肝脏TAGs代谢紊乱具有较好的调节作用。见图2。

2.3 各组小鼠肝脏中各类磷脂及溶血磷脂的变化MDMS-SL分析结果表明，与正常组相比，模型组和各治疗组小鼠肝脏组织中各类磷脂的总含量未发生显著性变化（见表1）。根据MDMS-SL结果显示，模型组中不同类型的溶血性磷脂酰胆碱的含量变化趋势不同（见图3），表明模型组中磷脂酶PLA2的活性增强，水解生成大量不饱和脂肪酸用于合成生物活性物质，参与免疫炎症反应。经不同手段干预后，不同类型溶血性磷脂具有向正常水平回归的趋势，但差异无统计学意义，可能与该实验用药干预时间较短有关。

图2 各组鼠肝脏中TAGs分子的总含量

图3 正常小鼠和MRL/lpr 鼠肝脏中各种溶血性磷脂胆碱的含量

表1 各组小鼠肝脏中各类磷脂和鞘脂总含量（）

表1 各组小鼠肝脏中各类磷脂和鞘脂总含量（）

注：磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺浓度单位为nmol/mg 蛋白，其余均为pmol/mg 蛋白

脂质种类 正常组 模型组 激素组 中西医结合组 狼疮定组磷脂酰胆碱 48.38±3.77 51.93±1.76 54.08±2.58 51.52±3.16 49.58±3.05磷脂酰乙醇胺 30.58±2.45 31.83±1.88 33.44±2.08 31.98±1.95 32.15±3.00磷脂酰甘油 996.08±28.79 1036.57±71.22 1028.25±79.91 1061.79±47.48 974.51±22.76磷脂酰肌醇 6926.97±668.24 5818.25±176.24 6331.4±299.57 5805.61±254.65 624.04±340.14鞘磷脂 2393.87±391.14 2364.38±66.72 2166.27±340.61 2666.24±247.25 2467.98±419.59

3 讨论

酰基肉碱类脂质是肉碱与不同脂肪酸形成的一类脂质，是脂肪酸穿过质膜进入线粒体发生β-氧化的重要中间体，因此其含量可以反应细胞能量代谢的水平及线粒体功能。本资料结果表明MRL/lpr小鼠肝脏存在一定的线粒体功能障碍，导致酰基肉碱类无法被利用，在组织中大量积累。与模型组相比，经不同手段干预后，各治疗组小鼠肝脏中的各类酰基肉碱类脂质均出现不同程度的下降，回调至正常水平。表明经治疗后，MRL/lpr鼠肝脏中线粒体功能得到了一定程度的恢复。

线粒体在脂肪酸β-氧化过程中会产生大量自由基，在线粒体功能存在障碍时，这些自由基会大量外逸，导致氧化应激水平升高［12］。HNEs是脂质过氧化的终产物，在正常生理浓度时，对各组织正常功能的发挥具有重要的意义。然而，在氧化应激状态下，此类化合物会破坏各种酶、跨膜蛋白及DNA的正常功能［11］。各类磷脂是生物体系中质膜和血液系统中各种脂蛋白的重要组成部分。另外，位于sn-2位上的不饱和脂肪酸在相应酶的作用下水解生成游离脂肪酸用于生成前列腺素、血栓烷素等生物活性物质。溶血性磷脂是仅含有一条脂肪酸链的磷脂类脂质分子，具有破坏细胞完整性的能力［11］。

狼疮定是由升麻鳖甲汤加减化裁而来，由干地黄、升麻、炙鳖甲、青蒿、白花蛇舌草、佛手、积雪草、炒薏苡仁、赤芍和生甘草组成，方中干地黄、赤芍可以清热凉血滋阴，升麻、白花蛇舌草清热解毒清斑，青蒿退热除蒸，佛手疏肝解郁，炒薏苡仁健脾祛湿，鳖甲“甘润咸寒，可安邪气经扰之阴，活血化瘀”，甘草解毒的护中，诸药合用，共奏解毒、祛瘀、滋阴之效。狼疮定主要针对SLE热毒血瘀阴虚的病机，再加上激素的耗伤真阴，加剧阴虚血瘀等证候。从现代药理学角度而言，方中多味中药含有大量具有抗氧化作用的活性成分物质，也验证经狼疮定治疗后，小鼠肝脏中脂质过氧化终产物的含量显著下降。因此，脂质组学也在一定程度上揭示狼疮定调节肝脏脂质代谢紊乱的作用机制，为狼疮定的进一步临床推广提供理论基础。

本研究利用MDMS-SL方法对各组小鼠肝脏组织中各类脂质进行定性定量分析。结果表明，经狼疮定或者联合GCs干预后，MRL/lpr狼疮鼠肝脏组织中酰基肉碱类脂质、HNEs、TAGs和溶血磷脂类脂质具有显著回归正常的趋势，表明狼疮定具有调节肝脏脂代谢紊乱的功能，其作用的机制可能与恢复线粒体功能，降低氧化应激水平及减少免疫炎症的发生密切相关。