在线固相萃取－高效液相色谱法测定人血清中左旋舒必利

裴后猛，潘媛媛，郑 立，郑明刚，赵全升，石 磊＊

（1．青岛大学环境科学与工程学院，山东青岛266071；2．中科谱研（北京）科技有限公司，北京100027；3．国家海洋局第一海洋研究所，山东青岛266061）

左旋舒必利作为一种苯甲酰胺类药物，其作用特点是选择性阻断中脑边缘系统的多巴胺（DA2）受体，对其它递质受体影响较小、抗胆碱作用较轻，无明显镇静和抗兴奋躁动作用，具有较强的与氯丙嗪相似的抗精神病作用。该药临床主要用于精神分裂症的系统治疗，还能有效防治一些抑郁症，对胃及十二指肠溃疡、晕眩、偏头痛等也有较好的治疗作用［1－3］。

有关血液中左旋舒必利的测定方法，国内外已有相关报道，主要为高效液相色谱－紫外检测法［4－5］、高效液相色谱－质谱法［6］、荧光分光光度法［7］、气相色谱法［8－10］等。其中，荧光法灵敏度低及专一性差；气相色谱法需要进行衍生化处理，操作繁琐，因此在临床上使用较少。血清样品基质复杂，需要前处理后才能进行检测。目前的前处理方法大多采用有机溶剂提取后，进行溶剂置换，操作复杂，且此类方法不能有效去除血清中的磷脂等内源性杂质，极易造成仪器污染。固相萃取法因为选择性强、富集倍数高等优势常用于生物样品分析中，但常规的离线固相萃取存在一些缺点，如操作繁琐费时、技术要求高、批次重现性难以保证等，在一定程度上限制了离线固相萃取的应用。本实验建立的在线固相萃取－高效液相色谱法，旨在简化操作步骤、降低分析成本，实现简单、快捷、准确、高灵敏的检测，满足临床检测的要求。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

Ultimate 3000双三元液相色谱系统（美国，赛默飞世尔科技公司产品），附二极管阵列检测器（DAD）。pHS－3C酸度计（上海雷磁仪器厂）；KQ－500DE型数控超声波清洗器（科桥超声仪器公司）；MS105DU电子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）。

左旋舒必利对照品（纯度：98%，北京百灵威科技有限公司）贮备溶液：取左旋舒必利对照品约10mg（精密称定），置于10mL容量瓶中，用30%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度为1 000μg／mL的左旋舒必利储备液，于冰箱内4℃保存备用，标准工作溶液用30%甲醇稀释配制。乙腈（色谱纯，美国J．T．Baker公司）；甲醇（色谱纯）、无水 KH2PO4（纯度＞99．0%）、无水 K2HPO4（纯度＞99．0%）（CNW 科技有限公司）；纯水由Milli－Q纯水机制备。

空白血清由北京某医院提供。

1．2 实验方法

1．2．1 液相色谱与在线固相萃取条件 固相萃取柱：CAPCELL PAKSCX UG80柱（10×4．0mm）；分析柱：Acclaim Mixed－Mode WCX－1柱（150×3．0mm，3μm）。固相萃取泵流动相 A为乙腈，流动相B为0．05mol／L无水KH2PO4溶液（pH＝4．5），等度洗脱，流速为1．0mL／min；分析泵流动相 A为乙腈，流动相B为0．05mol／L无水 K2HPO4溶液（pH＝6．4），等度洗脱，流速为0．7mL／min；柱温30℃，检测波长240nm，进样量为100μL。

本实验采用阀切换技术，所使用的切换阀是二位六通阀，系统流路连接见图1。

图1 在线固相萃取－高效液相色谱系统流路示意图Fig．1 Schematic diagram showing the online solid phase extraction－high performance liquid chromatography system

实验过程中，0～3．0min，切换阀处于6－1连接状态，固相萃取泵将血清上样至固相萃取柱，样品中左旋舒必利在固相萃取柱中保留，而蛋白等大分子物质不保留，直接流入废液；3．0～4．0min，切换阀处于1－2连接状态，分析泵流动相将左旋舒必利溶液从固相萃取柱转移到分析柱上；4．0～15．0min，切换阀处于6－1连接状态，固相萃取泵冲洗固相萃取柱并为下一针样品平衡，分析泵继续完成左旋舒必利的分离，具体洗脱程序和阀切换参数见表1。

表1 在线固相萃取和阀切换参数Table 1 Online solid phase extraction and valve switching parameters

1．2．2 样品处理 空白人血清样品在－20℃冰箱中保存，使用前取出，放置至室温。吸取5mL血清和2倍体积的甲醇充分混合后，加左旋舒必利储备液150μL，以4 000r／min离心10min，取上清液，即为血清标准储备液，浓度为10μg／mL。将血清标准储备液依次用30%甲醇稀释，得到浓度分别为0．1、0．5、1．0、2．0、5．0、10．0μg／mL的标准系列溶液，于冰箱内4℃保存备用。

2 结果与讨论

2．1 条件优化

2．1．1 固相萃取柱和分析柱的选择 CAPCELLPAKSCX UG80柱是一种阳离子交换柱，它的特殊结构能够使得蛋白质等大分子化合物直接穿透不被保留，而对小分子碱性药物则有较好的保留，从而达到样品基质与目标分析物的有效分离，故选用此柱作为在线固相萃取柱。Acclaim Mixed－Mode WCX－1柱是一种特殊的高效硅胶基质色谱柱，键合相同时具有疏水保留和弱阳离子交换特性，对左旋舒必利可提供理想的选择性和极佳的柱效，故选用此柱作为分析柱。

2．1．2 流动相的选择 选择5%乙腈－95%KH2PO4缓冲溶液（pH＝4．5）作为固相萃取泵流动相，可实现左旋舒必利和样品基质有效分离。第一次阀切换时间确定后，用乙腈和K2HPO4缓冲溶液（pH＝6．4），选择0．7mL／min的流速，通过调节流动相比例，测试分析色谱柱的分离效果。当流动相比例为70∶30（V／V）时，Mixed－Mode WCX－1分析柱上左旋舒必利出峰时间约为9．5min，且实际血清样品分析时，不受基质峰的干扰，最终选择体积比为70∶30的乙腈－磷酸盐缓冲溶液（pH＝6．4）作为分析柱流动相。

2．2 分析方法的评价

2．2．1 专属性 按实验方法，分别处理标准溶液和血清加标溶液，进样分析。在选定的液相色谱条件下，舒必利的保留时间为9．48min，峰形良好，血清样品中加标左旋舒必利（1 000ng／mL）色谱图见图2。

2．2．2 标准曲线 配制50、100、200、400、800、1 000、1 200、1 600ng／mL的标准工作溶液，以左旋舒必利峰面积为纵坐标（y），浓度（x）为横坐标，结果显示左旋舒必利在50～1 600ng／mL的浓度范围内，其标准曲线方程为：y＝0．0156x＋0．0050（r＝0．9997），线性关系良好。

2．2．3 检出限与定量限 将血清标准储备液稀释至10ng／mL，5次进样检测，结果显示左旋舒必利峰信号与噪音比（S／N）均值为10．7；将血清标准储备液稀释至3．5ng／mL，5次进样检测，结果显示左旋舒必利峰信号与噪音比S／N均值为3．2。以测得S／N≥3、S／N≥10的标准血清加标样品的浓度分别为检出限和定量限。血清中左旋舒必利的检出限为3．5ng／mL，定量限为10ng／mL。

2．2．4 精密度和回收率 制备低、中、高（50、500和1 000ng／mL）3种浓度的血清加标样品，每个浓度进行6次平行测定，进行日内与日间的精密度验证。结果显示，左旋舒必利在低、中、高3个浓度水平的加标回收率均在85．0%～102．9%范围，日内、日间相对标准偏差（RSD）为1．3%～7．2%，准确度和精密度结果良好，具体见表2。

图2 血清样品中左旋舒必利加标色谱图Fig．2 Chromatogram of levosulpiride in spiked samples

表2 左旋舒必利的精密度与回收率Table 2 Precision and recovery of levosulpiride in human serum spiked samples

2．2．5 稳定性 制备低、中、高（50、500和1 000ng／mL）3个浓度的血清加标样品，室温（25℃）下放置，分别在0、2、4、6h进样检测，测试样品稳定性。结果显示，低、中、高浓度水平下，各放置时间检测值的RSD分别为0．1%、0．8%、0．5%，表明左旋舒必利在室温放置6h稳定性良好。

2．3 治疗药物分析

根据AGNP精神科治疗药物监测共识指南2011［11］，对于常见精神药物均给出了推荐的治疗参考浓度范围，左旋舒必利的治疗参考浓度范围为200～1 000ng／mL。本实验对该浓度范围最低点200ng／mL进行加标验证，结果显示测得该浓度水平加标回收率为93．8%，最高点1 000ng／mL的加标回收见精密度和回收率部分，表明该方法能够满足实际样本检测的要求。

3 结论

本文建立了血清中左旋舒必利在线样品前处理－液相色谱分析方法，可以实现左旋舒必利低至10ng／mL浓度的准确检测。本法专一性及耐用性强，样品前处理简单，很大程度上避免了样品前处理过程中由于人为因素造成的误差，适合临床推广，可广泛用于批量样本中左旋舒必利的浓度检测和药代动力学研究。